裂殖壶藻油提取及高浓度 EPA/DHA分离纯化工艺研究

为实现藻油中ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PUFAs)的简单、绿色、高效分离纯化工艺,首先利用裂殖壶菌原始菌株及定向驯化菌株ALE40为原料提取油脂,通过优势性评估及细胞通透性对比二者提油效果,并通过测定油脂指标对比3种提油方法(酸解法、超声干法、超声湿法)优劣。对超声湿法提取的粗藻油采用酯交换法进行乙酯化后,联合尿素包埋法和分子蒸馏技术富集高浓度二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA),对酯交换及尿素包埋工艺条件进行单因素实验优化,通过对分子蒸馏重相DHA和EPA含量测定确定分子蒸馏级数,并对纯化藻油的理化指标进行测定。结果表明:相比裂殖壶菌原始菌株,ALE40的细胞通透性明显较好,在无需干燥的情况下,超声10 min即可达到最高油脂得率(53.2%),缩短超声时间的同时提高了破壁效率;3种提油方法中超声湿法提取的藻油理化指标较好;酯交换反应最佳条件为反应温度60℃、KOH添加量3%、醇油比10∶1、反应时间0.5 h,尿素包埋最佳工艺条件为脲酯比0.8∶1、溶酯比8∶1、包埋温度4℃、包埋时间8 h;尿素包埋后的藻油经二级分子蒸馏纯化后,藻油中EPA和DHA总含量从17.40%(酯交换反应)升高到90.86%,总回收率为62.28%;得到的纯化藻油的各项理化指标均符合行标要求,且储存3个月内无沉淀,具备一定稳定性。综上,该提取分离纯化工艺全程实现试剂循环利用,且制备的藻油酸值低、无异味。

氮源调控Schizochytrium sp.DP-16发酵产DHA油脂

利用一株海洋真菌Schizochytrium sp.DP-16发酵产DHA油脂,从有机氮源、无机氮源两方面研究不同氮源种类和浓度下DHA油脂积累情况。利用GC分析DHA占总脂肪酸的质量分数,结果表明,在牛肉膏、玉米浆、蛋白胨、酵母浸粉4种有机氮源中,添加酵母浸粉15 g/L,油脂产量达到20.7 g/L,相比对照组提高了16.9%。添加谷氨酸钠10 g/L,油脂产量为22.8 g/L,DHA占总脂肪酸质量分数的36.6%,相比对照组提高了11.2%和28.4%。硝酸钠、硫酸铵、氯化铵3种无机氮源中,添加氯化铵1.5 g/L,DHA产量占总脂肪酸的质量分数高达41.5%,相比对照组提高了17.5%。油脂发酵结果表明,添加酵母浸粉15 g/L和谷氨酸钠10 g/L氮源复配条件下发酵效果可观。

“海洋强国”战略下海洋药学综合实验教学实践探索

为适应海洋强国战略下海洋医药人才需求,培养高技能应用型人才,根据海洋药学专业人才培养目标,探索设计了从裂壶藻发酵、藻油生产与质量控制以及相关产品研发的综合实验项目。本文从实验设计背景、设计内容、教材建设、实验运行和实验考核方面对实验教学实践进行阐述。该综合实验成功应用于海洋药学专业本科实验教学中,对学生进行多学科、多技术交叉训练,提升了学生的专业技能和创新思维,为今后工作打下基础。

饲粮胆碱和裂殖壶菌油联合添加促进二十二碳六烯酸在鸡蛋卵黄中的富集

本试验旨在研究饲粮添加胆碱与裂殖壶菌油(Schizochytrium oil,SO)对鸡蛋卵黄脂质及二十二碳六烯酸(DHA)富集的影响。选取26周龄京红蛋鸡288只,分4组(每组6个重复,每重复12只鸡)。采用2×2因子试验设计,饲粮添加胆碱(500和1 000 mg/kg)和SO(0和0.5%)为2个主效应,共配制4种等氮等能饲粮。预试期1周,正试期8周。结果表明:1)试验期内,各组生产性能和蛋品质均无显著差异(P>0.05)。2)各组卵黄中干物质、粗脂肪、胆固醇及甘油三酯含量均无显著差异(P>0.05)。1 000 mg/kg胆碱组卵黄总磷脂含量显著高于500 mg/kg胆碱组(P<0.05)。胆碱和SO对卵黄总磷脂含量有显著交互作用(P=0.04),1 000 mg/kg胆碱+0.5%SO组卵黄总磷脂含量最高。3)0.5%SO显著提高卵黄n-3多不饱和脂肪酸(PUFA)和DHA含量(P<0.05),显著降低n-6 PUFA含量及n-6 PUFA/n-3 PUFA值(P<0.05)。胆碱和SO对卵黄中n-3 PUFA(P<0.001)、n-6 PUFA(P=0.01)及DHA(P<0.001)含量和n-6 PUFA/n-3 PUFA值(P=0.01)有显著交互作用,1 000 mg/kg胆碱+0.5%SO组卵黄中n-3PUFA和DHA含量显著高于其他组(P<0.05),且n-6 PUFA含量及n-6 PUFA/n-3 PUFA值显著低于其他组(P<0.05)。综上,本试验条件下,饲粮中1 000 mg/kg胆碱和0.5%SO联合添加可促进卵黄DHA富集,且对蛋鸡生产性能和蛋品质无显著影响。

响应面优化水酶法提取裂壶藻油的工艺

以裂壶藻干藻粉为原料,以清油得率为评价指标,采用两步酶解法提取油脂。在单因素实验的基础上,对清油得率影响较大的碱性蛋白酶的作用条件应用响应面法进行优化,依据回归分析确定碱性蛋白酶的最适作用条件。结果表明,水酶法提取裂壶藻油的最适工艺条件为:料液比1∶7,中性蛋白酶添加量7%,酶解温度45℃,酶解时间3 h,酶解p H 6.5;碱性蛋白酶添加量10%,酶解温度68℃,酶解时间6 h,酶解p H 9.4。在最适工艺条件下,裂壶藻清油得率可以达到(91.37±0.14)%。气相色谱-质谱分析裂壶藻油中不饱和脂肪酸含量为47.43%,其中DHA含量为35.09%。

pH值对裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸的影响

p H值是裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)的重要操作参数之一,培养液的p H值环境直接影响菌体的生长及代谢产物的合成。控制不同p H值条件,检测发酵过程培养液p H值的变化规律,采取适当的调控手段,使菌体处于生长及合成油脂和DHA的最佳状态。研究发现培养液控制在前4天p H值为3,后2天p H值为5时总脂和DHA的产量较大,分别为9.92 g/L和4.14 g/L。

酶法破碎裂殖壶菌提取胞内油脂

采用酶法破碎裂殖壶菌提取胞内油脂,进行单因素实验和正交实验优化酶解反应条件,酶解反应的影响因素主次顺序依次为酶用量、温度、时间、pH,最佳酶解工艺参数:55℃、pH 9.5、搅拌反应2.5 h、酶用量为菌体生物量的2%。在该条件下,胞内油脂的提取量高达(81.53±0.33)g/L,过氧化值仅为0.15,酸价为0.24。

两步酶法提取裂壶藻油的工艺优化

采用两步酶法提取裂壶藻油并对工艺进行优化。通过单因素和正交实验,确定了提取裂壶藻油的最佳工艺条件,并通过验证实验对正交结果进行验证。得到的最佳工艺条件为:料液比1∶7,中性蛋白酶添加量9%,酶解温度45℃,酶解时间3 h,酶解pH6.5;碱性蛋白酶的添加量为12%,酶解温度70℃,酶解时间6 h,酶解pH9.5。在此条件下的清油得率可以达到90.22%。气相色谱-质谱(GC-MS)分析裂壶藻油中不饱和脂肪酸含量44.13%,DHA含量为32.06%。

微藻粉替代鱼油对星斑川鲽幼鱼生长、体组成和生理指标的影响

为探讨微藻粉替代鱼油对星斑川鲽(Platichthys stellatus,Pallas 1788)幼鱼生长、体组成和生理指标的影响,以鱼油为主要脂肪源配制基础饲料(FO),分别用裂壶藻粉(SO)、微绿球藻粉(NO)及两种藻粉的混合物(MO)替代鱼油中的DHA、EPA,不足部分用玉米油补齐,制成4种等氮等能的实验饲料,投喂星斑川鲽幼鱼(初始体重7.35 g±0.03 g)90 d。结果显示,与FO组相比,SO组的生长性能无显著差异(P>0.05),NO组和MO组特定生长率、蛋白质效率和脏体比显著降低(P<0.05),饲料系数显著增大(P<0.05);MO组的全鱼粗蛋白含量显著高于其他组(P<0.05),FO组与MO组的全鱼粗脂肪含量显著高于其他组(P<0.05),FO组背肌粗灰分含量显著低于其他组(P<0.05);藻粉替代鱼油对肌肉和肝脏脂肪酸组分影响显著,肌肉的C16:0和DHA含量与其在饲料中所占的百分比呈显著正相关(r=0.973,0.967,P<0.05),C14:0和C16:1n-7呈极显著正相关(r=1.00,0.996,P<0.01),肝的C18:2n-6、n-6 PUFA和DHA/EPA呈显著正相关(r=0.983,0.976,0.977,P<0.05),C16:1n-7呈现极显著正相关(r=0.992,P<0.01);NO组和MO组血清谷丙转氨酶(ALT)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)和碱性磷酸酶(ALP)的含量较FO组显著降低(P<0.05),NO组血清谷草转氨酶(AST)和葡萄糖(GLU)含量显著低于其他组(P<0.05)。研究表明,本实验条件下裂壶藻粉可以替代星斑川鲽幼鱼饲料中的鱼油而不对其生长和生理指标产生负面影响,并且在一定程度上能提高星斑川鲽的营养价值。

裂殖壶菌胞内油脂尼罗红荧光染色快速检测方法的研究

为了建立快速检测裂殖壶菌胞内油脂的方法,探讨了尼罗红荧光染色法检测裂殖壶菌油脂含量的检测条件。通过考察裂殖壶菌重悬液中添加二甲基亚砜体积分数、尼罗红染液用量、染色温度、染色时间及细胞密度对荧光强度的影响,确立最优检测条件,进一步考察细胞油脂含量与荧光强度的关系,从而建立尼罗红荧光检测法的定量关系。结果表明,最优检测条件为：每毫升裂殖壶菌重悬液中二甲基亚砜体积分数和尼罗红染液用量分别为25%和15μL,染色温度50℃,染色时间15 min。在最优检测条件下,细胞密度不超过0.218×10^8个/m L范围内,菌液油脂含量（X）与荧光强度（Y）呈现良好的线性关系,其线性关系式为Y=798.55X-3.44,相关系数R2为0.996 4。因此,采用尼罗红荧光染色法可以快速检测裂殖壶菌的油脂含量。

裂殖壶菌油脂成分及抗氧化活性分析

为研究裂殖壶菌油脂成分及抗氧化活性,采用气相色谱-质谱和核磁共振技术分别对裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成和脂质成分进行分析,并对油脂的自由基清除能力和总抗氧化能力进行测定。结果表明:裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成简单,主要为C14∶0(13.22%)、C16∶0(26.78%)、C22∶5n-6(DPA,13.66%)和C22∶6n-3(DHA,42.04%);其脂质成分以甘油三酯为主,含有少量游离脂肪酸,且C22∶6n-3和C22∶5n-6等多不饱和脂肪酸主要结合于甘油三酯的sn-2位。同时,裂殖壶菌油脂具有较好的DPPH、ABTS+和羟基等自由基清除能力和总抗氧化能力,且在10~50 mg/mL质量浓度范围内呈现显著的量效关系(P<0.05)。裂殖壶菌油脂富含C22∶6n-3和C22∶5n-6等多不饱和脂肪酸,且具有较好的抗氧化活性,因此其具有较高的营养价值和功能油脂开发潜力。本研究为裂殖壶菌油脂成分分析、抗氧化活性评价以及功能性油脂开发提供了理论依据。

裂殖壶菌油脂水酶法提取工艺优化及其脂肪酸组成分析

采用水酶法对裂殖壶菌油脂的提取工艺进行研究,通过单因素和正交实验优化提取工艺条件,并对裂殖壶菌油脂的脂肪酸组成进行分析。实验结果表明,水酶法提取裂殖壶菌油脂的最佳工艺条件:复合酶配比2∶8(纤维素酶∶中性蛋白酶,U∶U),液料比4 m L/g,加酶量2 500 U/g,酶解温度55℃,酶解时间4h;在此优化条件下,裂殖壶菌油脂提取率为82.47%。裂殖壶菌油脂脂肪酸以C14∶0、C16∶0、C22∶5n-6和C22∶6n-3为主,其脂肪酸组成简单,且C22∶6n-3质量分数高达32.65%,表明裂殖壶菌油脂具有很高的营养价值和功能性油脂的开发潜力,可作为C22∶6n-3的重要食药来源。

紫苏提取物对裂壶藻油氧化稳定性的影响

目的:探究紫苏提取物对裂壶藻油氧化稳定性的影响。方法:采用强制氧化法,以过氧化值、丙二醛值、茴香胺值、共轭二烯值作为评价指标,探究不同浓度紫苏提取物、0.04%茶多酚与0.02%TBHQ对裂壶藻油氧化稳定性的影响,采用气相—质谱检测裂壶藻油中脂肪酸成分的变化。结果:强制氧化15 d后,0.10%紫苏提取物组不饱和脂肪酸含量相比空白组提高了16.91%,紫苏提取物可以通过延缓不饱和脂肪酸的氧化分解,起到抗氧化效果,紫苏提取物对裂壶藻油的氧化抑制效果略低于TBHQ,不饱和脂肪酸含量仅减少了5.30%,紫苏提取物添加组相比茶多酚添加组不饱和脂肪酸含量增加了12.93%,抗氧化效果明显高于茶多酚。结论:紫苏提取物能够有效提高裂壶藻油的氧化稳定性,且随着提取物剂量的增加,其延缓氧化效果也更加显著。

鱼油与微藻和植物油脂肪酸成分比较及其替代策略分析

【目的】水产养殖业的快速发展和鱼油价格的快速上涨,使得寻找能够替代鱼油的脂肪源日趋紧迫。【方法】采用直接转酯化进行气相色谱鉴定的方法测定鱼油、多种常见植物油和两种微藻的脂肪酸组成,以37种脂肪酸标准品作为参照,比较分析3类脂肪源的异同。【结果】鱼油的脂肪酸组成与微绿球藻(Nannochloropsis sp.)和裂壶藻(Schizochytriumsp.)相似,但植物油与鱼油相比缺乏EPA和DHA等n?3高不饱和脂肪酸。在满足必需脂肪酸需求的前提下,提出两种替代鱼油的策略:1使用38.0%亚麻籽油配合27.7%微绿球藻藻油和34.3%裂壶藻藻油替代鱼油的策略获得与鱼油一致的n?3/n?6多不饱和脂肪酸比率,能够较好地满足鱼类的营养需求,可作为替代鱼油的首选策略;2使用38.0%大豆油配合27.7%微绿球藻藻油和34.3%裂壶藻藻油替代鱼油的策略则获得与鱼油大体相同的主要脂肪酸类别,价格较亚麻籽油组低廉,可作为备选策略。【结论】使用高EPA和DHA含量的微藻藻油配合植物油替代鱼油在理论上是可行的。

响应面法优化裂殖壶菌产DHA油脂的发酵培养基

采用响应面法对海洋真菌Schizochytrium sp.产DHA油脂的发酵培养基进行优化。通过单因素试验确定了以葡萄糖为碳源、酵母浸粉为氮源、谷氨酸钠为外源添加剂3个主要因素。根据Box-Behnken中心组合设计,以DHA油脂产量为响应值,对Schizochytrium sp.DP-16的发酵培养基进行响应面优化。优化后的培养基组成为葡萄糖83.60 g/L,酵母浸粉11.75 g/L,谷氨酸钠9.30 g/L,海水晶15 g/L,MgSO4·7H2O 5 g/L,KH2PO4·H2O 7 g/L。优化后DHA油脂产量提高了4.5%。

裂殖壶菌粉碱热法破壁提取其胞内油脂

裂殖壶菌是一种能积累DHA海洋真菌,细胞壁结构紧密,坚韧,对其破壁是油脂提取工业化生产的重要工序。本实验探讨了不同破壁温度、碱浓度、破壁时间等因素对其菌粉碱法破壁提取油脂、DHA得率等指标的影响,确定碱热法破壁提取DHA的最佳条件为:温度80℃,复合碱用量为1.0%,破壁时间2.4 h,在该最佳条件下进行重复实验,可得到DHA粗油得率为90.65%。经优化后的破壁工艺经济高效,具有相应的经济应用价值。

利用裂殖壶藻藻渣提升黑水虻油脂营养价值的研究

为探究不同水平的裂殖壶藻藻渣对黑水虻幼虫生长及脂肪酸组成的影响,试验将含0、10%、20%、30%及40%藻渣的日粮饲喂8日龄的幼虫(均重12.74 mg,体长6.33 mm),直到对照组幼虫末重约100 mg时结束试验,养殖周期共9 d,随后检测幼虫生长指标、概略养分及脂肪酸组成。结果表明,养殖3、6 d及9 d后,10%藻渣组幼虫体重及体长与对照组均无显著性差异(P>0.05)。养殖3 d后,20%、30%及40%藻渣组体重显著低于对照组(P<0.05),20%、30%及40%组体长显著低于对照组(P<0.05);养殖6 d后,20%藻渣组体重显著低于对照组(P<0.05),体长与对照组无显著性差异(P>0.05),30%及40%藻渣组体重及体长显著低于20%组(P<0.05);养殖9 d后,20%组体重及体长显著低于对照组(P<0.05),30%及40%藻渣组体重及体长显著低于20%组(P<0.05)。10%藻渣组的粗蛋白质与粗脂肪含量与对照组无显著性差异(P>0.05),20%、30%及40%藻渣组粗蛋白质及粗脂肪含量显著低于对照组(P<0.05)。脂肪酸组成显示,10%、20%、30%及40%藻渣组MUFA含量显著低于对照组(P<0.05),20%、30%藻渣组n-3 PUFA含量显著高于10%组。研究表明,黑水虻幼虫饲喂日粮中藻渣的适宜添加水平在10%以内为宜。

裂壶藻突变株S1的细胞生长及其油脂合成的超微结构

本研究以裂壶藻野生株ATCC20888和其突变株S1为研究对象,通过透射电子显微镜观察细胞的生长和胞内油脂产生情况,比较分析了二者的细胞生长及胞内油脂合成规律。结果表明:突变株S1的细胞生长发育及油脂形成速度显著高于野生株,突变株S1藻细胞从生长第1 d起即明显可见单个藻细胞生长,随着培养过程的进行,S1细胞体积基本不变,并且难以看出囊膜包裹的多个藻细胞整体;细胞生长初期,S1胞内油脂呈单个透明状颗粒,随后油滴体积逐渐增大、连结成块、颜色呈深黑色,并可见片状油脂,基本充满整个细胞。本研究从显微水平揭示了不同藻株细胞生长和油脂合成的变化规律,科学解释了不同细胞油脂产量差异的原因,为后续深入理解裂壶藻的细胞生长过程和油脂合成机理提供了一定指导。

裂殖壶藻藻油DHA对高脂饮食诱导肥胖小鼠的影响

【目的】肥胖症是一种慢性代谢类疾病,具有较高的发病率和高危后果。研究表明,n-3多不饱和脂肪酸(n-3 Polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs),特别是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid,DHA)对与肥胖症相关疾病有较好的防治效果,对体内脂质代谢有重要的调节作用。探讨裂殖壶藻(Schizochytrium sp.)藻油DHA对高脂饮食诱导肥胖小鼠体重、脂肪组织重量、血脂、肝和脂肪组织病理形态和脂质代谢相关基因表达的影响。【方法】通过高脂饮食建立小鼠肥胖模型,以体重增幅15%为标准分出肥胖小鼠。试验共分五组:(1)低脂对照组;(2)高脂模型组;(3)高脂+低剂量藻油组(50 mg DHA/kg);(4)高脂+中剂量藻油组(100 mg DHA/kg);(5)高脂+高剂量藻油组(200 mg DHA/kg)。其中,藻油处理组灌服相应剂量藻油,低脂对照组和高脂模型组灌胃同等体积玉米油。处理9周后,腹腔麻醉,摘眼球取血并分离血清,测血清中甘油三酯、胆固醇和高密度脂蛋白含量;之后处死小鼠,分离附睾、肾周和肠系膜脂肪组织及肝脏,称湿重;附睾脂肪和肝组织切片进行HE染色,观察病理变化情况;利用RT-PCR检测附睾脂肪组织中激素敏感脂酶(Hormone sensitive lipase,HSL)基因的m RNA表达情况。【结果】藻油处理组小鼠体重没有显著下降,但是腹部脂肪重量显著降低、脂肪细胞体积明显小于高脂模型组;同时血清中甘油三酯、胆固醇含量显著降低,肝组织异位脂肪堆积明显减少;脂肪组织中HSL基因的表达水平显著提高。【结论】裂殖壶藻藻油DHA处理能显著降低高脂饮食导致的小鼠腹部脂肪积累并改善血脂,可能有利于肥胖症的防治。