国人SCN5A基因新的同义突变位点

目的研究中国人心原性猝死相关基因SCN5A突变位点。方法采用聚合酶链反应和DNA测序对1例RQT间期综合征(LQTs)和2例特发性J波患者SCN5A基因进行突变检测。结果①3例患者在国内、外已知的SCN5A突变位点上,均未发现有突变。②发现1个新的同义突变(T990C),位于钠通道α-亚基的DⅠ区段S5～S6胞外环上。结论这个新的同义突变可能通过影响门控性钠通道的跨膜电流而与恶性心律失常的发生相关。

Nav1.5/SCN5A基因新的变构体编码人脑组织Nav1.5 Na^+通道

河豚毒-抵抗性(TTX-R)Nav1.5 Na+通道是心肌的特异性Na+通道,虽然研究发现神经元中也存在河豚毒-抵抗性Na+电流及Nav1.5/SCN5A mRNA的表达,但其确切的cDNA序列尚不清楚.采用RT-PCR法对人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA进行克隆发现:人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA有2种变构体,hB1和hB2(accession number EF629346,EF629347),其中hB1全长6201个碱基,其开放读码框架(ORF)参与编码2016个氨基酸,和人心肌Nav1.5 Na+通道氨基酸序列相同率高达98%,共有28个不同的氨基酸,其中7个集中位于第6A外显子与第6外显子编码区.与人心肌Nav1.5/SCN5A基因cDNA不同的是,在对人脑组织Nav1.5/SCN5A基因cDNA的克隆中未发现该基因第18外显子的选择性剪接,但却发现其第24外显子的选择性剪接,2种选择性剪接体(hB1和hB2)在脑组织中基本同时表达,表达比率接近1∶1,但在心脏中二者的表达比率却与年龄有关.人Nav1.5/SCN5A基因的第24外显子定位于染色体3P21区,共有54个碱基,参与编码18个氨基酸.RT-PCR法证实第24外显子的选择性剪接也可发生在大鼠心脑之外的其他组织中,竞争性PCR法证明,不同组织中2种选择性剪接体的表达比率不同,且随着周龄的增加,2种选择性剪接体在各组织中表达的变化趋势不同.此外,RT-PCR法还发现Wistar大鼠全身16种组织中均可检测到Nav1.5/SCN5A mRNA的表达.上述实验结果说明,Nav1.5 Na+通道在全身组织中分布广泛,但编码人脑组织Nav1.5 Na+通道与心肌组织该离子通道的cDNA序列不同,是Nav1.5/SCN5A基因的2种变构体,这为深入研究不同组织中Nav1.5 Na+通道的功能提供了基础.

硒对异丙肾上腺素致损伤大鼠心肌SCN5A基因表达的影响

目的研究异丙肾上腺素(ISP)致大鼠心肌损伤模型中,编码电压门控Na+通道α亚单位基因SCN5A表达的变化,以及硒对其表达的影响。方法24只Wistar大鼠雌雄各半,随机分为3组,即对照组、ISP组、硒+ISP组。测定心肌丙二醛(MDA)的水平;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blot方法检测心肌SCN5A基因的表达变化。结果与ISP组比较,硒+ISP组MDA显著降低(P<0.05),但高于对照组(P<0.05);ISP组SCN5A基因mRNA和蛋白的表达均较对照组显著增加,而硒+ISP组降低其表达。结论异丙肾上腺素可使心肌SCN5A基因mRNA和蛋白的表达显著增高;硒对异丙肾上腺素致大鼠心肌损伤有保护作用并能逆转ISP引起的SCN5A基因表达的改变。

Brugada综合征SCN5A基因G1712C突变的功能分析

目的探讨Brugada综合征SCN5A基因新突变G1712C的电生理机制。方法采用体外定点诱变法构建携带有基因突变G1712C的p Rc/CMV-h H1的表达载体,lipo3000脂质转染法建立稳定表达p GFP-IRES-hβ1质粒的HEK293细胞系,并用G418进行筛选鉴定。分别做野生型的p Rc/CMV-h H1(h H1)和携带有基因突变G1712C的p Rc/CMV-h H1(mh H1)瞬时转染表达。进行全细胞膜片钳实验记录钠通道电流。实验结果由Patch Master以及IGOR Pro 6.0软件分析。结果 G1712C位于Na+通道蛋白α亚单位的DⅣ区S5与S6之间的P-loop上。在瞬时转染野生型的h H1的细胞系中,指令电位从-60 m V逐渐上升时,钠电流也渐变大,在-20 m V时完全激活;激活电压在-60 m V到-50 m V,反转电位在50 m V左右。在瞬时转染突变型G1712C的细胞系中,没有发现钠电流。结论野生型h H1所表达的钠通道蛋白与正常心肌细胞钠通道电生理特性相似。SCN5A基因G1712C突变导致Nav1.5通道失去功能,可能是该家系Brugada综合征的病因。

心脏传导阻滞SCN5A基因L1001Q突变体构建和功能研究

目的对作者发现的一个中国3代人心脏传导阻滞家系SCN5A基因新突变L1001Q,构建突变表达载体,利用分子生物学方法和全细胞膜片钳技术观察L1001Q突变的功能。方法一步定点诱变法构建pEGFP-L1001Q-SCN5A突变体;激光共聚焦和Western blotting技术检测突变蛋白定位和表达;全细胞膜片钳技术观察突变体钠电流。结果野生型和L1001Q突变均表达在细胞膜上,且表达量无明显变化。二者最大激活电流分别为(148.34±0.77)pA/pF和(132.59±0.96)pA/pF(P>0.05),L1001Q突变半失活电压V1/2为(-73.25±0.87)mV,较野生型正向转移约3.5mV[V1/2为(-76.71±0.73)mV,P<0.05],L1001Q突变失活后恢复时间常数较野生型稍减小,差异无统计学意义(WT tau=16.8ms,L1001Qtau=14.1ms,P>0.05)。结论 L1001Q突变未影响钠通道蛋白的表达和转运,主要通过改变钠通道门控特性引起钠通道功能减弱进而导致心脏传导阻滞。

表达心脏SCN5A基因的人胚肾细胞钠电流特性及其对钠通道阻滞剂的反应性

目的利用人胚肾293细胞表达心脏钠通道SCN5A基因并研究其钠电流特性和对钠通道阻滞剂的反应性。方法野生型SCN5A基因和SCN1B基因共表达于人胚肾293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录给药(氟卡尼与利多卡因)前后的钠电流。结果 SCN5A基因转染效率约为60%;测试电压为-40mV时记录到钠电流峰值大小约为-8nA;100μmol/L的氟卡尼轻度抑制钠电流,使钠电流峰值减少(21.1±4.6)%[(-435.8±30.5)pA/pF vs.(-343.9±27.1)pA/pF,P<0.01];氟卡尼使钠通道激活曲线和失活曲线均呈负向移动,改变的幅值分别是-6.08mV[(-51.88±1.20)mVvs.(-57.96±0.79)mV,P<0.05]和-9.08mV[(-94.12±0.13)mVvs.(-103.20±0.11)mV,P<0.05];1Hz和10Hz频率刺激时,氟卡尼使钠电流分别减少(64.5±10.7)%和(83.5±12.2)%(P<0.01);30μmol/L利多卡因使钠通道失活后快恢复时间常数和慢恢复时间常数分别延长2倍和3倍。结论表达心脏钠通道SCN5A基因的人胚肾293细胞模型可用于基因特异性的钠通道阻滞剂安全性与药效学筛查。

钠通道重叠综合征相关基因SCN5A在H9C2细胞中的表达

目的构建表型重叠家系相关基因SCN5A del QKP1507-1509突变型真核表达载体,研究其在H9C2细胞中的表达。方法一步法定点诱变技术构建SCN5A基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体,电穿孔方法将野生型和突变型质粒转染至H9C2细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)及Western blot技术检测其mRNA及蛋白表达情况。结果琼脂糖凝胶电泳法及DNA直接测序法均表明定点突变成功,RFQ-PCR及Western blot结果显示,野生组、突变组和混合组SCN5A基因mRNA相对表达量分别为1.089±0.459、1.011±0.840和1.069±0.492,3组SCN5A基因mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。野生组、突变组和混合组SCN5A蛋白在H9C2细胞的相对表达量分别为3.781±0.221、3.466±0.176和3.714±0.198,3组SCN5A蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建钠通道基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体并转染至H9C2细胞,该突变未引起钠通道在细胞膜的异常表达,为进一步功能研究提供了研究基础及方向。

SCN5A基因单核苷酸多态性与壮族原发性癫痫易感性的相关分析

目的探究SCN5A基因单核苷酸多态性(SNP)与壮族原发性癫痫易感性的相关性。方法应用病例对照研究,收集广西百色地区确诊的原发性癫痫患者155例作为研究对象,同期健康体检者200例作为对照组,采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术和直接测序法对患者外周血SCN5A基因中rs6599230和rs1805126位点基因多态性检测,评估两组患者不同基因型和等位基因的分布频率与癫痫易感性的关联性。结果 rs6599230和rs1805126位点均检测到CT、TT和CC 3种基因型。癫痫组与对照组相比,rs6599230等位基因分布(χ~2=11.030,P=0.001)和基因型分布(χ~2=11.147,P=0.004)的差异均具有统计学意义;rs1805126等位基因分布(χ~2=0.080,P=0.928)和基因型分布(χ~2=0.786,P=0.675)的差异均无统计学意义。与CC+CT基因型相比,rs6599230位点的TT基因型显著增加了癫痫发病的危险性(OR=1.921,95%CI:1.230～2.998)。结论 SCN5A基因rs6599230位点SNP可能与壮族原发性癫痫易感性有关。

新疆维吾尔族人群SCN5A基因在单纯性先天性心脏病中的相关性分析

背景:SCN5A是目前报道最多的编码心肌钠离子通道的基因,SCN5A基因编码人心脏电压门控钠通道的α亚基,在人心肌细胞中高度表达,其主要负责动作电位的产生和兴奋细胞的扩展,对控制心肌细胞的兴奋传导起着关健作用。目的:研究SCN5A基因H588R,C5457T,R1193Q位点多态性与新疆地区维吾尔族单纯性先天性心脏病的相关性。方法:选取150例新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病患者作为病例组,150例新疆维吾尔族健康人群作为对照组。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术和直接测序法对SCN5A基因H588R,C5457T,R1193Q位点进行多态性检测,分析不同基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组中的分布。结果与结论:两组比较多态位点C5457T,R1193Q的基因型频率和等位基因频率差异均有显著性意义(P<0.05);多态位点H588R的基因型频率差异有显著性意义(P<0.05),而等位基因频率差异无显著性意义(P﹥0.05)。与对照组比较,C5457T位点在房间隔缺损和动脉导管未闭患者中等位基因频率分布差异有显著性意义(P<0.05),等位基因T分布增加房间隔缺损、动脉导管未闭的发病风险,OR值分别为3.636和3.467。R1193Q位点在房间隔缺损、法洛氏四联症和卵圆孔未闭患者中等位基因频率分布差异有显著性意义(P<0.05),等位基因A分布增加房间隔缺损、法洛氏四联症和卵圆孔未闭的发病风险,OR值分别为3.413,3.839和4.059。结果证实,SCN5A基因多态位点C5457T,R1193Q可能是新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病的易感因子;未发现多态位点H558R与新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病直接相关。

国人确诊及疑似Brugada综合征患者SCN5A基因变异筛查

目的探讨国人Brugada综合征(BrS)患者及疑似者中SCN5A基因变异情况。方法对5例确诊和12例疑似BrS患者及部分家属进行临床分析并随访,用直接测序法检测SCN5A基因多态/突变情况。结果在1例确诊者中发现R1913C错义突变;在17例患者中共发现10种单核苷酸多态性(SNPs)位点,分别为G87A、703+130G>A、1141-3C>A、A1673G、G3578A、3840+73G>A、4245+81G>T、4245+82A>G、4299+53T>C、T5457C。其中在1例疑似患者中发现的位点4245+81G>T为首次报道。结论首次在BrS患者中发现R1913C突变;同时在一例疑似患者中发现了1种新SNP4245+81G>T。

SCN5A基因多态性与糖尿病心脏病变患者左室功能的关系

目的探讨分析SCN5A基因多态性与糖尿病心脏病变患者左室功能的关系。方法选取102例糖尿病合并心脏病变患者(T2DM+HD组)、96例单纯T2DM患者(T2DM组)及60例健康人员(NC组),分析3组SCN5A基因C5457T位点基因多态性,随访分析不同基因分型患者心血管事件发生情况。结果T2DM+HD组高血压史、HbA1c、TG、LDL-C、HDL-C、hs-CRP、FFA、VE/VA、IVST、LVMI、LVEF、LVEDD,与T2DM组比较差异有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。T2DM+HD组TT基因型、T等位基因频率高于NC组、T2DM组,差异有统计学意义(χ~2=20.678、23.135、9.677、10.747,P <0.01)。Logistic回归分析,高血压史、HbA1c、TG、HDL-C、hs-CRP、FFA、IVST、LVMI为T2DM+HD的影响因素。TT型患者TG、LDL-C、HbA1c、hs-CRP、FFA、IVST、LVMI,与CC型、CT型比较差异有统计学意义(P <0.05或P <0.01)。TT型患者出现心血管事件累积发生风险与CC型、CT型患者比较,差异有统计学意义(Log χ~2=5.586、4.763,P=0.015、0.027)。结论 SCN5A基因C5457T位点多态性与糖尿病心脏病变患者左室功能障碍有一定相关性,TT基因型患者心血管事件发生率高。

青壮年不明原因夜间睡眠中猝死SCN5A基因型研究

【目的】研究中国汉族人群青壮年不明原因夜间睡眠中猝死(SMDS)病例的SCN5A基因型特征。【方法】选取120例中国汉族人群散发SMDS病例,提取其基因组DNA,对PCR产物(包含编码区及外显子-内含子拼接区)进行直接测序。鉴定基因内的遗传变异,以相同人群健康组作对照。【结果】120例SMDS散发病例中共发现SCN5A的11个突变位点,其中,Y1434Y、L1566L为编码区同义突变,V95I、R121Q、R367H、R1512W为已报道的错义突变,R513H、D870H、V1202M、V1764D、S1937F为本研究新发现的错义突变。【结论】首次较全面地获得了中国人SMDS病例SCN5A基因型特征,丰富了SMDS的分子病理学数据库,同时,为进一步探索心脏钠离子通道功能异常与SMDS发病机制的相关性提供了新的信息。

Brugada综合征一家系中2例患者的SCN5A基因突变及意义

目的观察Brugada综合征一家系中2例患者的SCN5A基因突变情况,并探讨其意义。方法选择Brugada综合征一家系2例患者,采用直接测序法对其SCN5A基因突变进行检测。结果该家系中发现1个纯合变异,即SCN5A基因第28外显子上的同义变异(C5457T),其所编码的1819位天冬氨酸密码子没有发生改变。结论该Brugada综合征家系2例患者的SCN5A基因上存在1个同义变异,但SCN5A基因不是患者的致病基因。

低氧对大鼠心肌细胞蛋白激A活性与SCN5A基因表达的影响

目的研究低氧对培养大鼠心肌细胞蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)与SCN5A基因表达的影响。方法将原代培养的大鼠乳鼠心肌细胞随机分为5组:对照组、低氧(5%CO2+2%O2+93%N2)培养1h组、6 h组、12 h组和24 h组,利用非放射性方法测定各组细胞内PKA活性,利用RT-PCR和Western blot等方法检测各组SCN5A基因表达情况。结果各组PKA活性:低氧1h组和低氧6 h组高于正常组(P<0.01),低氧12 h组和24 h组低于正常组(P<0.01)。SCN5AmRNA相对表达量与蛋白质表达量:低氧1h组和低氧6h组显著高于对照组;低氧12 h组和低氧24 h组显著低于对照组。结论低氧对培养细胞内PKA活性与SCN5A基因的表达有一定调节作用,且对PKA的作用早于对SCN5A基因表达的作用,PKA可能参与影响大鼠心肌细胞缺氧后SCN5A基因的表达。

遗传性长QT综合征HERG基因及SCN5A基因新突变

目的:研究长QT综合征患者基因突变、致病机制及其与临床表型之间的关系。方法:分析长QT综合征患者的临床表现、心电图特点,应用聚合酶链式反应(PCR)扩增长QT综合征的常见突变基因KCNQ1,HERG,SCN5A的全部外显子及外显子与内含子连接部位,DNA直接测序检测基因突变位点。应用实时定量PCR方法测定一个家系的成员基因表达量,以探讨其可能的致病机制。结果:在5个长QT综合征家系中,发现2个HERG基因突变位点及1个SCN5A基因突变位点,分别为HERG基因C1848A、G1120T和SCN5A基因G638T。其中HERG基因C1848A突变引起616位酪氨酸转变为终止密码子(Y616X),G1120T突变引起374位缬氨酸转变为苯丙氨酸(V374F);SCN5A基因G638T突变引起213位甘氨酸转变为缬氨酸(G213V)。HERG基因Y616X突变患者家族成员外周血mRNA表达量分析,发现其HERG基因mRNA表达量明显低于无突变者。结论:发现3个长QT综合征相关的基因新突变位点,两个突变位于HERG基因,另一个位于SCN5A基因。其中HERG基因无义突变Y616X引起mRNA表达量减少,可能受无义突变介导的RNA降解(Nonsense Mediated Decay,NMD)机制有关,从而引起较轻微的临床症状。

青壮年猝死综合征与SCN5A基因突变的相关性

近几年来,国内外青壮年不明原因猝死的报道逐年增多,对其死因的界定是法医工作者深感棘手的问题。随着病因学向分子水平的深入,心脏病研究已用分子遗传学技术证实了一类“原发性心电紊乱”导致的心律失常与SCN5A突变引发的钠通道疾病有关,本文回顾了法医学中青壮年猝死综合征(SMDS)的特征及临床医学中几种疾病的基因型和表型,分析其相关性,期望为进一步研究获得一些启示。

中国汉族人Brugada综合征患者SCN5A基因Ⅳ区一个新的突变

背景 Brugada 综合征是一种易导致猝死的具有遗传倾向的疾病,与编码心肌钠通道的基因突变有关。目的研究中国 Brulgada 综合征患者 SCN5A 基因的碱基改变情况。方法对15例先证者及家系进行直接SCN5A 基因测序。DNA 来源于患者外周血白细胞。全部28个外显子通过设计的40对引物进行 PCR 扩增,扩增后的产物直接测序。结果在一个家系上发现了一个错义突变,即 G5080A(R1628Q),该突变导致心肌细胞钠通道的α亚基第Ⅳ结构域的第4片段发生改变。在150个正常对照者未发现此碱基改变。结论 G5080A(R1628Q)可能是中国 Brugada 综合征患者 SCN5A 基因新的突变位点。

中国汉族人群SCN5A基因H558R、P1090L、4299+53T>C及D1819D的多态性研究

目的了解中国汉族人群SCN5A基因单核苷酸多态性少见等位基因频率分布情况。方法在社区体检人群中选择126例作为研究对象,采用限制性片段长度多态性分析(RFLP)对SCN5A基因的H558R、P1090L、4299+53T>C及C5457T(D1819D)多态位点进行基因型鉴定,并随机选取样本采用ABI3700毛细血管电泳进行序列测定验证酶切结果。结果SCN5AH558R、P1090L、4299+53T>C及C5457T(D1819D)在中国汉族人群中的少见等位基因频率分别为11·1%、5·2%、28·2%及31·8%,与日本及国人先前的研究结果不尽相同。结论SCN5A基因的单核苷酸多态性存在种族差异。

SCN5A基因变异与左心室肌致密化不全心力衰竭相关性研究

目的:分析左心室肌致密化不全(LVNC)并发心力衰竭者心脏钠通道alpha亚单位SCN5A基因变异情况,探讨该基因与LVNC心力衰竭的关系。方法:从62例LVNC的先证者外周血中提取DNA,并行SCN5A基因的DNA序列分析来检测该基因的变异。结果:共发现了7种变异,分别是rs6599230:G>A、c.453C>T、c.1141-3C>A、rs1805124:A>G(p.H558R)、rs1805125:C>T(p.P1090L)、c.3996C>T和rs1805126:T>C。合并有心力衰竭者SCN5A基因的变异率(53%)高于无心力衰竭者(4%),差异有统计学意义(P=0.000 2)。结论:SCN5A基因变异与LVNC并发心力衰竭有关。

中国新疆地区汉族、维族健康儿童SCN5A基因单核苷酸多态性及其与先天性心脏病的关系

目的主要对钠离子通道基因(SCN5A基因)A29A和D1819D多态性与中国新疆地区汉族、哈萨克族、维吾尔族先天性心脏病(简称先心病)发病的相关性进行分析。方法健康儿童(健康组)350例(维吾尔族145例,汉族110例,哈萨克族95例),先心病儿童(先心病组)350例(维吾尔族145例,汉族110例,哈萨克族95例),进行聚合酶链反应扩增SCN5A基因所有外显子序列,对其产物进行核酸序列检测,对检测到的位点进行统计学分析。结果新疆地区儿童中发现9个单核苷酸多态位点(SNPs),通过对多态位点A29A和D1819D进行统计分析,汉族、哈萨克族、维吾尔族健康儿童中A29A和D1819D的基因型频率和等位基因频率差异有统计学意义(P<0.05),汉族、哈萨克族基因型频率和等位基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。A29A和D1819D的等位基因频率和基因型频率在汉族、维吾尔族先心病组和健康组中分布均有统计学意义(P<0.05),A29A等位基因频率和基因型频率在哈萨克族先心病组和健康组中分布均无统计学意义(P>0.05),D1819D基因型频率也无统计学意义(P>0.05),但等位基因频率有统计学意义(P<0.05)。结论 SCN5A基因A29A、D1819D位点在新疆汉、维吾尔族先心病人群中存在多态性,D1819D可能在哈萨克族先心病人群中存在多态性,SCN5A基因可能是新疆地区先心病发病的易感基因。