粘毛黄芩毛状根培养体系的建立及其黄芩苷的动态合成

目的:建立粘毛黄芩毛状根培养体系,并对其生长特性和次生代谢产物的合成进行初步探索。方法:采用卸甲型根癌农杆菌Agrobacterium tumofaciens C58C1感染粘毛黄芩无菌苗的茎段,获得毛状根,并得到了优质株系;测定了毛状根的生长曲线;利用PCR对毛状根进行T-DNA转化的检测及利用HPLC进行黄芩苷含量检测。结果:PCR检测结果表明,发根农杆菌Ri质粒的rolC基因已整合入粘毛黄芩毛状根基因组中。C58C1感染粘毛黄芩无菌苗茎段8 d后,毛状根陆续在其伤口处产生,28 d时幼茎产生毛状根的外植体达81%。1/2 MS液体培养32 d后毛状根干重增加了17.42倍,总黄酮和黄芩苷含量分别增加了21.60,25.56倍。结论:粘毛黄芩毛状根离体培养的建立为进一步进行药用活性成分的工业化生产奠定了基础。

粘毛黄芩根的化学成分研究

目的研究粘毛黄芩 (ScutellariaviscidulaBge )化学成分。 方法利用各种色谱技术进行分离纯化 ,根据理化性质和光谱数据进行结构鉴定。结果分离得到 8个化合物 ,分别鉴定为 :千层纸素A(oroxylinA ,Ⅰ )、汉黄芩素 (wogonin ,Ⅱ )、白杨素 (chrysin ,Ⅲ )、5 ,7,4′ 三羟基 8 甲氧基黄酮(5 ,7,4′ trihydroxy 8 methoxyflavone,Ⅳ )、黄芩素 (baicalein,Ⅴ )、粘毛黄芩素Ⅲ (viscidulinⅢ ,Ⅵ )、粘毛黄芩素Ⅰ (viscidulinⅠ ,Ⅶ )、汉黄芩素苷 (wogonoside,Ⅷ )。结论化合物Ⅲ。

粘毛黄芩CHS基因的克隆分析及其正反义植物表达载体的构建

目的:获得粘毛黄芩查尔酮合成酶(CHS)基因正反义植物表达载体,通过转化粘毛黄芩进一步探讨CHS在黄酮化合物生物合成途径上的作用机理。方法:通过RT-PCR从粘毛黄芩总RNA扩增出CHS基因目的片段,克隆至PMD18-T载体,测序并进行生物信息学分析。结果:测序证明序列正确,同时推测出CHS氨基酸序列及三维结构。克隆片段和pCAMBIA1304+载体用BlgII和BstE II双酶切,然后连接CHS基因目的片段及pCAM-BIA1304+载体大骨架片段,得到CHS正反义植物表达载体。结论:成功构建粘毛黄芩CHS基因正反义植物表达载体,并通过冻融法转化C58C1和LBA4404,为农杆菌介导的粘毛黄芩CHS基因对植物的遗传转化奠定基础。

高效液相色谱法测定蒙药粘毛黄芩中黄芩苷的含量

目的采用高效液相色谱法测定粘毛黄芩中黄芩苷含量。方法色谱条件为:采用C18柱,以甲醇-1%冰醋酸的水溶液(54∶46)为流动相,检测波长280 nm。结果平均回收率98.7%,RSD为0.96%。结论此法简便、灵敏、快速、可靠、重复性好,可用于粘毛黄芩药材的质量控制。

外界因子对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响

目的:研究不同外界因子对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响.方法:研究不同基本培养基、pH值、碳源及激素对粘毛黄芩毛状根生长和黄酮类化合物合成的影响.结果:30g.L-1蔗糖、pH 5.8的1/2MS培养基最适合毛状根生长,但黄酮类化合物合成最高时pH值为6.4.外源激素NAA、GA对毛状根的生长有促进作用,GA效果最为明显.结论:初步优化了粘毛黄芩毛状根的培养条件,为实现粘毛黄芩黄酮类化合物大规模生产奠定了基础.

黄芩及粘毛黄芩种子形态的电镜扫描比较

目的为准确鉴别黄芩和粘毛黄芩种子提供形态学依据。方法采用扫描电镜法对两黄芩种子种表面超微特征进行比较观察,对其进行鉴别。结果黄芩与粘毛黄芩种子之间在种皮表面超微结构特征上具有明显差别,可用于鉴别。结论利用扫描电镜可以有效鉴别两种黄芩种子。

黄芩、粘毛黄芩及沙滩黄芩种子的蛋白质电泳鉴别

目的建立黄芩、粘毛黄芩和沙滩黄芩种子的蛋白质电泳图谱,将图谱作为黄芩种子及混淆品鉴定的指征。方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对3种黄芩种子的蛋白质电泳图谱进行分析。结果不同产地的黄芩种子的电泳图谱基本一致,同属3种黄芩种子的蛋白质电泳图谱具有明显差异。结论聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱可作为鉴别3种黄芩种子的指征。

粘毛黄芩毛状根外源基因表达系统的建立

用携带植物高效表达载体pCAMBIA1304+和发根型质粒pRiA4,"解除武装"的重组C58C1工程菌感染粘毛黄芩(Scutellaria viscidula Bunge.)无菌苗的幼茎、子叶、叶片,诱导毛状根的表达,以建立基于粘毛黄芩毛状根的高效外源基因表达系统。幼茎毛状根诱导率最高,达88.9%。PCR扩增检测粘毛黄芩毛状根单克隆基因组中的rolC和hygr基因片段,结果表明,pRiA4和pCAMBIA1304+均能整合到粘毛黄芩毛状根的基因组内,共转化率达28.1%。

粘毛黄芩SvFNSⅡ-2基因克隆及生物信息学分析

目的:克隆获得粘毛黄芩中黄芩苷合成关键酶黄酮合成酶Ⅱ-2基因(FNSⅡ-2)全长,并进行生物信息学分析。方法:以粘毛黄芩总RNA为模板,采用RACE技术和序列克隆相结合的方法,获得粘毛黄芩FNSⅡ-2基因的cDNA完全编码序列并进行生物信息学分析;采用实时定量(qPCR)和高效液相色谱技术(HPLC)测定粘毛黄芩采收期不同部位FNSⅡ-2的表达量及黄芩苷的含量,并对二者进行回归及相关性分析。结果:获得SvFNSⅡ-2基因ORF区长度为1 518 bp(GenBank ID:MG737856),编码氨基酸505个,包含3个高度保守区域,分析预测编码稳定的亲水性蛋白为游离核糖体合成的胞内膜结合蛋白,二、三级结构均以α-螺旋为主体,且包含有多个磷酸化位点;qPCR和HPLC结果显示,SvFNSⅡ-2基因的表达和黄芩苷含量在根、茎、叶中均存在极显著差异(P<0.01),而且不同部位间SvFNSⅡ-2基因表达量和黄芩苷含量呈极显著正相关关系(r=0.999,P<0.01)。结论:首次克隆获得SvFNSⅡ-2基因cDNA全长,初步证明SvFNSⅡ-2是粘毛黄芩黄芩苷合成途径中重要的调控关键基因,为揭示黄芩苷分子合成机制及调控研究奠定了基础。

粘毛黄芩丛生芽的诱导及快速繁殖

[目的]为粘毛黄芩种质保存和工厂化繁育提供理论依据。[方法]以粘毛黄芩无菌苗的幼茎为外植体,MS为基本培养基,分别对其进行启动、丛生芽及生根培养,建立粘毛黄芩离体培养再生体系。[结果]粘毛黄芩最佳丛生芽诱导培养基MS+6-BA 2.0 mg/L+IAA 0.2 mg/L,丛生芽分化率可达94.8%,平均丛生芽倍增数为11.6;试管苗生根培养基以1/2 MS+IAA 0.5 mg/L最好,生根率高达97.8%。[结论]该研究建立了粘毛黄芩的快速、高效无性繁殖体系。

黄花黄芩不同提取物的红外光谱研究

目的:分析黄花黄芩药材、水提物和醇提物的化学成分。方法:采用傅立叶变换红外光谱法(FT-IR)并借助于二阶导数谱及二维相关红外光谱(2D-FT-IR)进行分析。结果:黄花黄芩药材及其提取物有着各自稳定的光谱特征,谱图中位于1615cm^(-1)的芳环骨架振动峰是判断黄芩苷在不同黄花黄芩样品中含量高低的主要依据,而相应的二阶导数谱图可以大大提高原始谱图的分辨率。黄花黄芩药材经过提取,以黄芩苷为代表的主要活性成分得到有效富集,两种提取物中黄芩苷的含量明显增高;黄花黄芩醇提物中黄芩苷的含量又明显高于其水提物。结论:FT-IR能够简便、快速地提供药材提取物中主要化学成分的定性与半定量信息,从而为后续的化学成分分析和药材提取分离工艺的改进提供有效参考。

Autotetraploidy induced in Nianmaohuangqin (Radix Scutellariae viscidulae) with colchicine in vitro

OBJECTIVE:To establish and optimize the propagation of Nianmaohuangqin(Radix Scutellariae Viscidulae) and induce and characterize polyploidy of Nianmaohuangqin(RadixScutellariaeViscidulae).METHODS: Buds from germinating seed-derived explants were induced by tissue culture. With an orthogonal test, different concentrations of 6-benzylaminopurine(BAP), indole-3-acetic acid(IAA) and kinetin(KT) were used to determine the optimal concentrations for the propagation of Nianmaohuangqin(Radix Scutellariae Viscidulae). The different concentrations of IAA and rooting powder(ABT) were used to induce rooting. A 0.3% w/v colchicine solution was used to induce polyploidy and the induced buds was identified by root-tip chro-mosome determination and stomatal apparatus observation.RESULTS: A large number of buds could be induced directly from epicotyl and hypocotyl explants on Murashige and Skoog(MS)(Murashige and Skoog 1962) medium supplemented with1.1-1.3 mg/L BAP and 0.2 mg/L IAA. Root induction anddevelopmentcouldbeobservedwithin20 days of inoculation on 1/2 MS medium supplemented with 0.2 mg/L IAA and 0.1 mg/L ABT. Furthermore,27 lines of autotetraploid individuals were obtained with a plantlet chromosome number of 2n=4x=36.CONCLUSION: Autotetraploid lines could be obtained through induction with colchicine in vitro,proving that this method might be used for plant selection and breeding.

蒙药材黄花黄芩定性定量方法研究

目的:建立蒙药材黄花黄芩定性定量方法,为提高黄花黄芩药材的质量控制水平提供依据。方法:参照《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2015年版附录相关方法及《国家药品标准工作手册》要求,对黄花黄芩药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分及醇溶性浸出物进行测定;以聚酰胺薄膜为薄层板,甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10∶3∶1∶2)为展开剂,以黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素为指标成分,在紫外灯365 nm处检视,建立薄层色谱鉴别方法;采用HPLC法建立黄花黄芩中黄芩苷的含量测定方法,使用Waters HHS T3(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-0.4%磷酸水溶液(47∶53)为流动相进行洗脱,流速1 mL·min^(-1),检测波长为280 nm处,柱温40℃,进样量为10μL。结果:在上述薄层色谱条件下,供试品色谱中与指标成分色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点,斑点Rf值适宜,显色清晰,色谱分离好,且信息量多。在HPLC条件下,黄芩苷质量浓度在10.32～103.2μg·mL^(-1)范围内,与峰面积呈良好的线性关系(r=0.999 7),平均加样回收率为93.7%～103.2%,RSD为0.78%～1.7%(n=9)。7批次黄花黄芩测定结果表明,黄芩苷的百分含量为5.65%～12.76%,水分为5.62%～6.65%,酸不溶灰分为0.33%～0.59%,醇溶性浸出物为44.10%～48.28%,以干燥品计算,黄花黄芩中黄芩苷的含量以不少于8.0%为佳。结论:建立的蒙药材黄花黄芩定性定量方法专属性强,准确度高,操作简便,可用于黄花黄芩的质量控制。

粘毛黄芩全草的化学成分研究

目的 研究粘毛黄芩Scutellaria viscidula全草的化学成分。方法 通过硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱及高效制备薄层色谱等方法对粘毛黄芩中的化学成分进行分离纯化,根据理化性质和波谱数据对其化学结构进行阐明。结果 从粘毛黄芩全草95%乙醇提取物中分离得到了22个化合物,分别鉴定为5-羟基-7,8-二甲氧基黄酮(1)、白杨素(2)、5,7-二甲氧基黄酮(3)、5,7,4′-三羟基-6-甲氧基黄酮(4)、5,7,4′-三羟基黄酮(5)、5,7,2′-三羟基-8-甲氧基黄酮(6)、5,7-二羟基-8,2′-二甲氧基黄酮(7)、5,7,2′-三羟基-6-甲氧基二氢黄酮(8)、5-羟基-6,7,8-三甲氧基黄酮(9)、5,6,7-三甲氧基黄酮(10)、3,5-二甲氧基-6,7-亚甲二氧基黄酮(11)、5,2′-二羟基-7,8,6′-三甲氧基黄酮(12)、5,2′-二羟基-7,8,6′-三甲氧基二氢黄酮(13)、5,7-二甲氧基二氢黄酮(14)、7-甲氧基白杨素(15)、2′-羟基-5,7,8-三甲氧基黄酮(16)、阿魏酸(17)、3-甲氧基-4-羟基苯甲酸(18)、对羟基苯甲醛(19)、3,5-二甲氧基-4-羟基苯甲酸(20)、6-甲氧基-7-羟基香豆素(21)、6,7-二羟基香豆素(22)。结论 化合物1、3~16、18和20为首次从该植物中分离得到。