ITS2条形码对白及属植物的初步分析研究

本研究通过ITS2条形码对云南白及本地种的分布情况初步了解,并对药用白及和云南本地种进行分析研究。选取滇东南、滇东北、滇西北、滇西的材料,进行DNA提取、PCR、测序,MEGA 5.1软件进行序列比对、NJ系统聚类树构建,并预测ITS2二级结构。结果表明:药用白及和本地种ITS2序列之间存在明显差异,在NJ树上分别聚为两类。ITS2可以区分药用白及和本地种,且可以作为初步分析药用白及真伪的潜在条形码。

应用rDNA ITS2区段基因序列分析对浙江省传疟媒介的鉴定

目的对浙江省传疟媒介种类进行鉴定,以指导疟疾防治工作。方法针对媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2(rDNAITS2)区段基因特征,应用PCR基因鉴别技术,对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp,与实验室中华按蚊标本一致。结论中华按蚊目前仍是浙江省的主要传疟媒介,现场调查未发现嗜人按蚊。

rDNA-ITS2应用于赤眼蜂分子鉴定的研究

本研究通过对拟澳洲赤眼蜂 Trichogramma confusum、甘蓝夜蛾赤眼蜂 T. brassicae、广赤眼蜂 T.evanescens、食胚赤眼蜂 T. embryophagum,及松毛虫赤眼蜂 T. dendrolimi的 6个地理种群的 r DNA- ITS2进行克隆测序 ,又运用软件 DNAStar的 Meg Align程序对不同赤眼蜂属间、赤眼蜂属种间、同种不同地理种群之间以及同一赤眼蜂个体不同拷贝之间的 ITS2序列的遗传分歧及相似性进行了分析。结果表明 :赤眼蜂属与外群 ITS2序列的遗传相似性很低、赤眼蜂属内不同种之间 ITS2序列保守性适中、种内或不同地理种群之间以及同一个体不同 ITS2拷贝间非常保守。说明

基于SCAR标记和DNA条形码技术的苍术基原鉴别研究

目的开发出能同时鉴别北苍术和关苍术的分子标记方法,并探究不同种质资源苍术的遗传进化关系。方法对不同地区北苍术Atractylodes chinensis(Bunge)Koidz及关苍术A.japonica Koidz.ex Kitam基因组DNA的差异片段进行测序,结合SRAP、ISSR、DAMD分子标记方法,优化PCR反应体系,筛选并转换成特异性标记,同时,采用条形码方法分析种间序列差异。结果通过SRAP、ISSR、DAMD三种分子标记方法的PCR扩增,共筛选出198对能稳定扩增且重现性好的引物,转换出7对能稳定、快速鉴别北苍术和关苍术的SCAR引物。条形码方法检测出北苍术ITS2序列长度为454 bp,关苍术ITS2序列长度为453 bp,与其他苍术属植物之间遗传距离较远。NJ树结果显示,北苍术、关苍术及其他苍术属植物均各自聚为一支,表现出良好的单系性。依据ITS2二级结构,4种苍术属植物在螺旋区的茎环数目、大小、位置均有明显差异,可以直观地进行区分。结论所开发的特异性SCAR标记为苍术属植物优良品种的筛选提供了新方法,DNA条形码能稳定、准确鉴别北苍术。

栀子栽培品种与近缘种的ITS2序列分析

【目的】栀子属植物是重要的观赏、药用、色素和油用资源植物,有着悠久的栽培历史。由于生长环境的不同,以及长期的人工栽培和选育,使其习性、叶的形状、花的形态、果实的形状及大小等发生诸多变异,使得栀子栽培群体的变异类型丰富,并形成了一些较为稳定的品种类型。开展栀子栽培品种和近缘种核糖体DNA内部转录间隔区2(nrDNA ITS2)序列变异程度、遗传距离和亲缘关系研究,为栀子属植物品种鉴定、遗传育种及多样性保护提供科学依据。【方法】以保存于江西省林业科学院中药资源圃内的栀子18个栽培品种和3个近缘种共38个样品为试验材料,进行聚合酶链式反应(PCR)直接测序法,对样品进行ITS2片段扩增和双向测序,所得序列用Codon Code Aligner v6.0.1软件拼接后,采用Lasergene Edit Seq 11.1软件进行平均碱基组成百分比统计,用MEGA7.0软件进行分析比对,获得序列长度、GC含量以及变异位点,基于K2P模型分析遗传距离,用UPGMA法构建系统聚类树。【结果】序列变异程度分析显示,狭叶栀子和栀子的ITS2序列长度均为347 bp,GC含量为66.86%,大黄栀子序列长度为355 bp,GC含量为67.61%,栀子栽培品种序列长度除‘燃叶’、‘金福水栀’为348 bp外,其他品种序列长度和栀子一致,均为347 bp,栀子栽培品种与近缘种间的平均GC含量相差不明显,GC含量为66.28%~67.15%,其中‘白蟾’GC含量最低,‘雀舌栀子’和‘银边雀舌’GC含量最高。所有样本ITS2序列比对共产生12个变异位点,10个碱基插入,其中8个碱基插入是大黄栀子所独有的,且存在5个特异的变异位点,一部分表型特征有共性的品种之间有共同的变异位点,如植株矮小、叶片小而窄长的品种‘雀舌栀子’和‘银边雀舌’在50 bp处,果实相对较大的品种‘分关1号’、‘金福水栀’和‘金元’在84 bp处等。一些品种具有特异的变异位点,如‘白蟾’(133 bp处)、‘小白蟾’(229 bp处)等。序列遗传距离分析显示,栀子属种间遗传距离普遍小于近缘种和品种间的遗传距离,大于栀子栽培品种之间的遗传距离,所有样本平均遗传距离为0.0055,大黄栀子和‘白蟾’间遗传距离最大,为0.0206。聚类分析结果显示,栀子属乔木树种大黄栀子单独成一支,与栀子属其它种和栀子栽培品种亲缘关系最远,狭叶栀子和野生栀子所有个体总体表现出较近的亲缘关系。【结论】分析结果表明,3种栀子属植物在ITS2序列长度和GC含量上表现出较高的保守性,研究发现的部分品种共同变异位点以及部分品种特异变异位点将对栀子品种鉴定有较大的应用价值。部分聚类结果和以表型数据为基础的数量分类结果类似,但并没有像数量分类结果那样以花重瓣、大果、小果等性状形成明显的系统分枝,研究结果对栀子品种起源、资源保护和种质创新等方面有重要的指导价值。

基于ITS2序列的藁本与常见混伪品的分子鉴定

本文对药材藁本及其常见混伪品的rDNA ITS2进行了PCR扩增、测序，并运用MEGA软件对该区进行序列分析，比较了ITS2碱基序列的差异及其规律，同时为药材藁本及混伪品的指纹图谱鉴别提供分子标记。结果显示辽藁本的种内差异较小，而与其主要混伪品间存在较大的变异，差异性范围为5．7％～35．3％。根据ITS2序列特征构建的系统树，药材藁本的样品紧密的聚在一起，和其混伪品可以明确区分，支持率为100％。此外，ITS2的二级结构可作为鉴定药材藁本及混伪品种的一个方法，具有一定的系统学及分类学意义。本研究表明rDNA ITS2序列分析可作为药材藁本与混伪品的一种有效的分子鉴定方法，具有重要的应用价值。

按蚊rDNA ITS2区段基因序列检测

目的鉴定浙江传疟媒介种类,为制定浙江省疟疾防治策略提供依据。方法利用媒介按蚊核糖体核酸内转录间隔2(rDNA ITS2)区段基因特征,应用PCR基因鉴别技术,对浙江省现场捕捉的按蚊与嗜人按蚊、八代按蚊、中华按蚊、雷氏按蚊实验室标本进行基因鉴别和比较。结果浙江省现场捕捉的按蚊DNA样本的PCR扩增产物均为250bp,与实验室中华按蚊标本一致。结论浙江省的传疟媒介是中华按蚊,现场调查未发现嗜人按蚊。

白前及其混伪品的ITS2分子鉴定

目的:采用ITS2序列鉴定白前及其易混伪品,为准确鉴别白前和保证临床用药的安全性提供参考。方法:白前与其混伪品的ITS2序列从Gen Bank数据库中获取,然后使用MEGA 6.06软件进行种内、种间序列变异分析、构建邻接系统树(NJ树)并计算遗传距离,运用ITS2数据库相似性搜索引擎预测ITS2二级结构。结果:白前ITS2序列长度在246~270 bp范围内,种内变异少且种间存在明显差异,与所有混伪品种间遗传距离为0.026~0.309。NJ树显示白前独聚一支,另外白前有明显ITS2二级结构特征,可与其混伪品明显区分。结论:ITS2序列能够有效地区分白前与其混伪品,为白前的用药安全提供技术保障。

新疆6种蚊虫的rDNA-ITS2区序列分析

测定并分析了新疆 ４种伊蚊和 ２种按蚊的 ｒＤＮＡ—ＩＴＳ２区序列，新疆伊蚊、刺扰伊蚊ＩＴＳ２区长度分别为 ２３１ｂｐ～２５６ ｂｐ、２５０ｂｐ或 ２５３ｂｐ，其克隆间、种内序列差异分别为 ０．３％～４．３％、０．８％～１．４％；里梅伊蚊与长刀伊蚊的长度为３３０ ｂｐ、２５１ ｂｐ，种内序列无差异；４种伊蚊种间序列差异明显大于种内差异水平，为１２．３％～３３．５％；赫坎按蚊和米赛按蚊的 ＩＴＳ２区序列长度分别为 ４６３ｂｐ、３１１ｂｐ，种内个体间无差异，而种间的差异为 ３０．８％．结果显示 ｒＤＮＡ－ＩＴＳ２区序列差异，为形态上易混淆蚊种提供了有意义的分子鉴别特征。

眼蚤属(Ophthalmopsylla)两蚤种的rDNA ITS2序列研究

目的:研究伏河眼蚤异常亚种Ophthalmopsylla volgensis extrema(Ioffet Scalon,1953)和长突眼蚤Oph-thalmopsylla kiritschenkoi(Wagner,1930)rDNA ITS2序列,为蚤类分子系统发育的研究提供基础资料。方法:PCR扩增两蚤种rDNA ITS2片段并测序,比较两者差异。结果:伏河眼蚤异常亚种rDNA ITS2序列长372 bp,长突眼蚤长380 bp;两蚤种间共有30处碱基不同,包括16处缺失/插入、4处转换、10处颠换,种内无差异。结论:rDNA ITS2序列可用作两蚤种鉴别的分子标记。

白色念珠菌ITS2的实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及评价

目的建立一种快速鉴定白色念珠菌的实时荧光定量PCR检测方法。方法在白色念珠菌核糖体RNA编码基因(r DNA)中的内转录间隔区2(ITS2)上设计特异性引物和Taq Man-MGB探针,通过实时荧光定量PCR分析系统建立白色念珠菌的检测方法,对其敏感度、重复性和特异性进行方法学评价,并在模拟白色念珠菌血症的血标本中初步探讨其应用价值。结果所建方法对白色念珠菌纯菌液的准确检测下限为101CFU/ml,相应的批内、批间变异系数(CV)分别为1.57%和2.20%。对135株白色念珠菌临床分离株、其他非白念菌株、细菌临床分离株和血液标本进行检测,结果显示该方法特异性为100%。另外,对于模拟白色念珠菌血症的血标本,该方法的最低检测下限为102CFU/ml。结论所建方法具有特异性和敏感度高、重复性好的特性,可适用于临床上白色念珠菌引起的血流感染的快速鉴定。

基于DNA条形码(ITS2)的中药材防风与其混伪品的鉴定

目的通过ITS2序列分析,对防风及其易混伪品进行鉴定,确保用药安全。方法从Gen Bank数据库下载中药材防风与其混伪品的DNA条形码ITS2序列,利用MEGA 6.06软件进行比对分析,计算GC含量及变异位点、种内、种间遗传距离,并构建NJ系统发育树,应用ITS2数据库网站预测其ITS2二级结构。结果序列分析与遗传距离结果显示,防风与其混伪品存在明显差异,基于ITS2序列的NJ树及其ITS2二级结构均可以将防风与其混伪品进行区分。结论 ITS2能够准确鉴定防风及其易混伪品,可用于中药材的快速鉴别。

利用ITS2序列识别盾蚧科昆虫

[目的]盾蚧科隶属于半翅目蚧总科,大多数种类是危害很严重的经济害虫。由于其外部形态特征简单,导致识别该类群物种相对困难。利用DNA条形码为解决这个问题提供有效的方法。[方法]共采集了5个省47个样本,属于7属11个种,并从GeneBank下载了4属5个物种的序列。采用distance-based方法和tree-based方法对ITS2基因片段是否可以作为盾蚧科DNA条形码的补充做了分析。[结果]虽然ITS2没有Barcode gap存在,然而所有的分支都表现出了明显的单系群,表现出较高的物种识别能力。同时,Best Match(BM)和Best closed match(BCM)也表现出了超过90%的识别能力。[结论]这些结果证实ITS2在盾蚧科物种的识别有效性方面具有较高的应用价值。

ITS2序列作为青风藤DNA条形码的研究

采用DNA试剂盒法提取采自不同地区的青风藤及其类似植物的基因组DNA,设计通用ITS2引物进行PCR扩增和测序,运用生物信息学软件对序列进行分析,从而对青风藤及其类似植物进行分子鉴定。结果表明：产地为陕西、贵州、湖北的青风藤样品序列长度分别为380~437、429~436、434~438 bp,GC含量在54.2%~55.7%,平均GC含量约为55%。青风藤及其类似植物的ITS2序列存在较大差异,且平均K2P遗传距离明显大于青风藤的种内平均K2P遗传距离。这说明内转录间隔区2（ITS2）作为DNA条形码可准确地鉴别青风藤与其他类似植物,为中药材的鉴别提供了新途径。

Sequence differences of rDNA-ITS2 and species-diagnostic PCR assay of Anopheles sinensis and Anopheles anthropophagus from China

Anopheles sinensis and An. anihropophagus are two morphologically indistinguishable yet genetically and behaviorally distinct mosquito species that vary dramatically in their importance as vectors of malaria inChina. The sequence of the ribosomal DNA internal transcribed spacer 2 (ITS2) was determined for bothspecies to assess the species differentiation. The lengths of ITS2 was 468 hp for An. sinensis and 452 hp forAn. anthropophagus. Interspecies difference in sequence was 28. 8%. Intraspecies sequence divergence wasnegligible. A PCR method was developed for distinguishing the two species based on the species-specific variations of the ITS2 sequences. The method would amplify a diagnostic fragment in length of 425 hp for An.sinensis and 253 hp for An. anthropophagus. Field collections from 12 localities in 10 provinces of China weretested. In 440 mosquitoes identified by adult morphological characteristics as An. sinensis, 291 (66. 2 % ) wereidentified later as An. sinensis and 56 (12. 7 % ) as An. anthropophagus, the remaining 93 (22. 1 % ) were notamplified by PCR. The results showed that the morphological characteritics of adult was not reliable for fieldidentification. The PCR assay was a simple, fast and reliable method for species identification.

基于DNA条形码和PCR-RFLP技术的进口紫草ITS2序列特征研究

目的:基于DNA条形码和PCR-RFLP技术研究进口紫草ITS2序列的特征,为市场紫草药材和饮片的质量控制与真伪鉴别提供参考依据。方法:选用ITS2区域作为对进口紫草和紫草对照药材进行比较、鉴定的DNA条形码序列,并基于DNA条形码和PCR-RFLP技术比较不同来源进口紫草的ITS2序列与紫草对照药材的异同。结果:39份进口紫草样品经限制性内切酶AluI酶切后,其产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,仅DH3在500 bp左右有条带,而在100~300 bp无条带,其余样品均在100~300 bp有2条或3条明显条带;进口紫草样品与紫草对照药材的ITS2序列进行比对,其中样品DH3与紫草对照药材的碱基差异最多,有15个碱基差异,样品F2与紫草对照药材的ITS2序列一致,其他进口紫草样品与紫草对照药材的碱基差异为1~9个碱基;从聚类结果中可以看出进口紫草样品DH3与其他进口紫草样品和紫草对照药材均明显区分,独自为一枝,而与紫草对照药材共同聚为一枝且支持率≥50%的样品共有14个。结论:选用ITS2区域,基于DNA条形码和PCR-RFLP技术,比较了进口紫草与紫草对照药材ITS2序列的异同,为紫草药材及饮片的有效鉴定提供参考依据,为紫草药材的市场监管提供有力保障。

中华按蚊和嗜人按蚊rDNA内转录间隔2区序列差异

目的：比较中华按蚊和嗜人按蚊核糖体ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）内转录间隔２区（ＩＴＳ２）序列差异。方法：通过对ＰＣＲ扩增的ｒＤＮＡＩＴＳ２片段进行克隆测序，每种蚊测定３个克隆片段序列，比较其差异。结果：中华按蚊和嗜人按蚊的ｒＤＮＡＩＴＳ２序列长度分别为４６８和４５２ｂｐ，ＧＣ含量分别为４４．８７％和４９．１２％，两者序列差异为２８．８％。

人工养殖与选育对罗氏沼虾遗传多样性的影响

为探讨人工养殖与选择育种对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)遗传多样性的影响,实验测定了孟加拉野生群体、缅甸野生群体、浙江养殖群体、广西养殖群体及选育群体"南太湖2号"共111只罗氏沼虾核糖体转录间隔区2(Internal transcribed spacer 2,ITS2)基因序列,结果发现58个碱基变异位点,定义56个单倍型。在5个群体中,孟加拉野生群体的遗传多样性最高(平均核苷酸差异数K和核苷酸多态性指数Pi分别为7.186和0.0155),依次为缅甸野生群体、浙江养殖群体、广西养殖群体,选育群体"南太湖2号"遗传多样性最低(K和Pi分别为3.032和0.0065)。5个群体间配对Fst分析表明,养殖群体与野生群体遗传分化显著(P<0.01),选育群体"南太湖2号"不仅与野生群体遗传分化显著,同时还与广西养殖群体产生了显著的遗传分化(P<0.01)。系统树显示,孟加拉野生群体和缅甸野生群体聚为一支,浙江养殖群体、广西养殖群体和选育群体"南太湖2号"则聚为另一支。研究结果表明,人工养殖和选育降低了罗氏沼虾的遗传多样性水平,并导致群体间发生了显著的遗传分化。

微小按蚊rDNA内转录间隔2区序列差异

目的 :比较不同地株微小按蚊核糖体DNA(rDNA)内转录间隔 2区 (ITS2 )序列差异。方法 :通过对PCR扩增rDNAITS2片段测序 ,比较其不同地株差异。结果 :对 6株微小按蚊测序比较 ,存在有微小按蚊A和C型。结论 :rDNAITS2序列差异可用于建立A。

11株螨虫分离株的ITS－2序列分析与系统关系研究

为探讨动物体上一些常见寄生螨虫的分类地位，对11株螨虫分离株的核糖体第二内部转录间隔区（ITS-2）基因序列进行测定，并从GenBank下载21条螨虫的ITS-2序列，用UPGMA法构建分子系统树。序列分析结果显示：6株疥螨分离株ITS－2基因全长均为361bp，含有335个保守性位点，15个变异位点和9个简约信息位点；序列间的同源性为96．9％～99．7％。5株足螨分离株ITS－2基因存在长度上的变异（225～232bp），序列中包括184个保守性位点，44个变异位点，9个简约信息位点；分离自黄牛和奶牛的4株足螨分离株的ITS-2序列同源性为92．4％～97．3％，而熊猫足螨分离株同黄牛、奶牛足螨分离株的同源性较低（78．7％～82．6％）。UPGMA显示：32株螨虫分离株分成2个支系，第1个支系包括疥螨科的疥螨属Sarcoptes和背肛螨属Notoedres；第2个支系包括痒螨科的足螨属Chorioptes和痒螨属Psoroptes。从分析结果来看，笔者支持疥螨的单种说法；而足螨属中分离自熊猫的足螨和痒螨属中分离自水牛的痒螨的分类地位还有待进一步探讨。