WIF-1、SFRP-1在环磷酰胺致大鼠神经管畸形中神经上皮细胞表达的变化

目的:通过检测WIF-1和SFRP-1在环磷酰胺(CP)致大鼠神经管畸形(NTDs)中神经上皮细胞的表达及表达的变化,研究CP对胎鼠神经上皮细胞Wnt信号通路的影响,探讨NTDs发生的分子机制,为NTDs的预防、基因治疗提供理论依据。方法:将SD孕鼠随机分为实验组和对照组,分别于妊娠13天8～9时一次性腹腔注射CP(15 mg/kg)和等量的生理盐水。分别于给药后8、12、24 h处死孕鼠,剖腹取出胎鼠,用10%中性福尔马林固定,常规石蜡包埋、连续切片。应用免疫组织化学方法检测WIF-1与SFRP-1在神经管神经上皮细胞的表达及其变化。结果:①WIF-1免疫组化显示,给药后8 h,实验组WIF-1阳性细胞分布与对照组相似(P>0.05);给药后12 h,实验组WIF-1阳性表达增强(P<0.05);给药后24 h,实验组与对照组相比,神经管背侧、顶板区WIF-1阳性表达明显增强(P<0.01)。②SFRP-1免疫组化显示,SFRP-1在实验组和对照组各个时间段均有阳性表达,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论:①WIF-1在神经上皮细胞表达增强与CP致NTDs密切相关。②SFRP-1在神经上皮细胞表达的改变未发现与CP致NTDs有相关性。③Wnt信号通路异常与CP致NTDs密切相关。

小鼠成骨细胞中分泌型卷曲相关蛋白1转录后调控机制的研究

目的 构建小鼠分泌型卷曲相关蛋白1 （secreted frizzle-related protein 1,SFRP1）基因3非编码区（untranslated regions,UTR）荧光素酶报告基因载体,探讨小鼠前成骨细胞系（MC3T3-E1）中SFRP1基因表达是否在转录后的翻译水平受到调控.方法 使用含50 mg/L抗坏血酸的成骨诱导液分别处理MC3T3-E1细胞0、7、10d,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶和β-肌动蛋白为内参,应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测细胞中SFRP1基因mRNA和蛋白的相对表达水平.使用PCR技术克隆SFRP1基因的3UTR区,连接到荧光素酶报告基因载体pMIR-REPORT上,构建的新载体命名为pMIR-REPORT-SFRP1UTR.分别将pMIR-REPORT-SFRP1UTR和pMIR-REPORT转染至MC3T3-E1细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）中,检测细胞中荧光素酶的表达水平.其中转染pMIR-REPORT-SFRP1UTR的细胞为pMIR-REPORT-SFRP1UTR组,转染pMIR-REPORT的细胞为pMIR-REPORT组.结果 成骨诱导0、7及10d后细胞中SFRP1的mRNA水平分别为1.00±0.12、1.97±0.34和4.98±0.99,诱导10d与0d相比差异有统计学意义（P＜0.05）.成骨诱导0、7及10d后细胞中SFRP1的蛋白水平分别为0.94±0.13、1.26±0.16及1.30±0.15,诱导7、10d与0d相比差异均无统计学意义（P＞0.05）.MC3T3-E1细胞pMIR-REPORT转染组和pMIR-REPORT-SFRP1UTR转染组的荧光素酶表达量分别为487±34和74± 10,二者差异有统计学意义（P＜0.05）.NIH3T3细胞pMIR-REPORT转染组和pMIR-REPORT-SFRP1UTR转染组的荧光素酶表达量分别为2 707±117和2 240± 175,二者差异亦有统计学意义（P＜0.05）.结论 成功构建了编码SFRP1基因3＇UTR区的荧光素酶表达载体.SFRP1基因的3UTR区参与了SFRP1基因的转录后调控,且这种调控具有一定的细胞特异性.