鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2和SO7蛋白的原核表达及SIgA抗体间接ELISA检测方法建立

【目的】建立检测鸡肠道黏膜柔嫩艾美耳球虫SIgA抗体的间接ELISA检测方法以期对鸡柔嫩艾美耳球虫特异性黏膜免疫水平进行评价。【方法】将鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC 2和SO 7基因克隆至pET-28a(+)原核表达载体,构建EtMIC2-SO7重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。采用镍柱亲和层析法对EtMIC2-SO7重组蛋白进行纯化,用Bradford法测定蛋白浓度。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定法,确定ELISA检测抗原、待检黏膜的最佳工作浓度,通过单一变量法确定最佳待检黏膜孵育时间、封闭液种类、酶标二抗、显色液工作条件,参照ELISA抗体检测试剂盒阴阳性判定标准,以S/P≥0.4为阳性,S/P<0.4为阴性作为黏膜样品阴阳性判定标准,对ELISA检测方法的重复性、特异性、敏感性进行验证并与鸡柔嫩艾美耳球虫全蛋白包被ELISA板检测结果进行符合率比较。【结果】SDS-PAGE和Western blotting结果显示,获得大小约70 ku的EtMIC2-SO7重组蛋白,与预期结果相符。ELISA检测方法的最佳抗原包被浓度为2μg/mL,待检黏膜最适稀释度为1∶40,待检黏膜最适孵育时间为2 h,最适封闭液为5%脱脂奶粉,最适酶标二抗稀释度为1∶100000,最适反应时间为1 h,最适显色时间为15 min;批内、批间重复性试验变异系数均<10%;与新城疫病毒、禽流感病毒、传染性法氏囊病病毒特异性SIgA抗体无交叉反应性;随机选择2份阳性肠道黏膜样品进行敏感性试验,稀释浓度为1∶80时2份样品仍判定为阳性,说明该检测方法敏感性较好;将EtMIC2-SO7重组蛋白和鸡柔嫩艾美耳球虫全蛋白分别包被ELISA板,检测18份肠道黏膜样品,结果表明EtMIC2-SO7重组蛋白包被ELISA板与球虫全蛋白包被ELISA板符合率可达88.9%(16/18)。【结论】本研究采用原核表达系统成功表达并纯化EtMIC2-SO7重组蛋白,并将其作为ELISA包被抗原,成功建立重复性好、特异性强、敏感性高的鸡柔嫩艾美耳球虫SIgA抗体的间接ELISA检测方法,为球虫黏膜免疫疫苗评价提供了初步检测方法。

蛋白酶激活受体-2激动药对重症急性胰腺炎大鼠肠道SIgA的影响

目的研究重症急性胰腺炎(SAP)大鼠肠黏膜免疫屏障的变化及蛋白酶激活受体(PAR)-2激动药对其的影响。方法制备SAP大鼠模型,采用PAR-2激动药进行预处理,检测假手术组、模型组及预处理组造模后6,12,24 h大鼠小肠黏液分泌性免疫球蛋白A(SIgA),小肠组织病理学、小肠组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6。组间数据比较采用单因素方差分析,小肠组织TNF-α、IL-6与小肠黏液SIgA,小肠组织病理学评分之间的相关性采用线性相关分析。结果模型组与假手术组相比,随造模时间的延长,小肠黏液SIgA浓度降低,小肠组织病理学评分及小肠组织TNF-α、IL-6水平升高(P<0.05),预处理组与模型组相比,小肠黏液SIgA浓度升高,小肠组织病理学评分及小肠组织TNF-α、IL-6水平降低(P<0.05),小肠组织TNF-α、IL-6水平与小肠组织病理学评分具有明显的正相关(P<0.01),与小肠黏液SIgA之间具有明显的负相关(P<0.01)。结论 SAP大鼠早期即发生肠黏膜免疫功能下降,免疫屏障受损;SLIGKV-NH2预处理SAP大鼠后,能显著降低小肠局部主要炎症因子水平,改善肠黏膜免疫屏障损伤程度。

SIgA分泌片分离、纯化研究

为了研究SIgA分泌片 (Secretorycomponent,SC)分离、纯化及鉴定方法 ,以SC存在游离和结合两种形式 ,本研究应用凝胶过滤和盐析法直接从初乳中分离纯化游离SC ,并进行鉴定。分离纯化获得蛋白溶液 12 4ml,蛋白含量 0 85mg/ml,免疫双扩仅与抗SC多克隆抗体 (PcAb)反应 ,分子量约 75kD ,免疫印迹实验与抗SC单克隆抗体(McAb)和PcAb特异反应 ,表明纯化蛋白为SC。该SC的分离纯化和鉴定处于不断完善之中 ,其方法的改进有利于获得更纯的SC 。

不同中医体质健康人群的唾液Cor及SIgA比较研究

目的:探讨不同体质健康人群中唾液Cor(salivary cortisol,SC)、分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulins A,SIgA)的含量分布及这两种生物指标间的关系。方法:纳入270例健康体检者。按照其体质特点分为9种体质,每组各30例,分别研究这9组人群中SC和SIgA的分布规律。结果:9组体质人群中各组的SC和SIgA含量分布均有一定区间范围,SC和SIgA呈正相关,r=0.65,P<0.05。结论:不同体质的健康人群中SC和SIgA分布有一定规律性,且SC和SIgA存在一定程度的相关,这两种指标具有作为体质评定和干预备选生物指标的潜能。

唾液SIgA、溶菌酶含量与牙周病关系的探讨

目的:探讨了牙周病患者唾液SIgA和溶菌酶含量的变化及临床意义。方法:应用放射免疫分析检测32例牙周病患者唾液SIgA含量、免疫扩散法检测溶菌酶含量,并与35名正常健康人作比较。结果:牙周病患者唾液SIgA和溶菌酶含量均非常显著地高于正常人组(P<0.01),经治疗1个月后与正常人组比较仍有显著性差异(P<0.05)。结论:检测牙周病患者唾液SIgA和溶菌酶含量的变化对临床观察预后有重要的临床价值。

鸡SIgA的提取鉴定及其抗体制备

实验采用饱和硫酸铵法从健康肉鸡胆囊收集的胆汁中粗提二聚体SIgA,继而透析粗提产物除盐,然后进行纤维素DEAE-52离子交换层析,使用紫外分光光度计测定收集液的蛋白浓度,对层析产物浓缩使其浓度≥2.0 mg/m l,最后使用SDS-PAGE进行鉴定,从电泳所得图像中可以看到清晰的两个条带,一个条带分子量在67～70 ku之间为重链,另一个条带在26～28 ku之间为轻链。进一步将纯化的鸡SIgA抗体免疫健康兔,制备得到兔抗鸡SIgA抗体。

结石性慢性胆系炎症患者胆汁sIgA的检测及意义

为观察结石性慢性胆系炎症患者手术前后胆汁。sIgA含量变化及意义，利用放射免疫法分别测定术中和术后14天胆总管胆汁sIgA含量。发现胆道术后残余结石患者胆汁中sIgA虽低于术前，但无显著性差异（P＞0．05），而无残余结石患者术后胆汁sIgA显著低于大前和有残余结石患者（P均＜0.01）。表明胆汁sIgA含量随局部炎症发生而增高．局部炎症减轻而降低。故胆汁sIgA的测定可作为胆道术后监测胆道炎症变化及有无残余结合的参考指标。

轮状病毒肠炎和鼠伤寒杆菌肠炎患儿粪便中SIgA含量测定

用放射免疫法(双抗体—PEG法)测定正常婴幼儿和轮状病毒肠炎及鼠伤菌肠炎各40例患儿粪便中SIgA的含量。结果表明轮状病毒肠炎及鼠伤寒杆菌肠炎之间粪便中SIgA含量无明显差异,而二者粪便中SIgA含量明显高于正常对照组。提示肠道SIgA在婴幼儿轮状病毒肠炎及鼠伤寒杆菌肠炎恢复中起重要作用。

SIgA在肠道免疫中的作用

分泌性免疫球蛋白A(SIgA)是由J链连接成的双聚IgA与SC(分泌片段)结合后形成的复合物,其分子量约为400kD。组成SIgA的三者之间互有作用,共同确保作为整体的SIgA能有效发挥免疫作用。此文就SIgA各组成部分的生成、调节及其在肠道发挥免疫保护作用的方式作一综述。

妇女孕早期炎性标志物NLR与母乳中sIgA的关系

目的探讨妇女孕早期中性粒细胞/淋巴细胞比例(NLR)是否会影响产妇成熟乳中的分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的浓度。方法研究对象来源于2018年6月至2019年6月在北京大学人民医院募集的产妇。产妇就诊当天自行采集母乳,工作人员将样本放入冰箱内-80℃保存。利用膳食频率调查问卷收集产妇哺乳期膳食情况。从孕期营养门诊获取产妇一般情况与孕早期血常规检查结果,计算NLR。使用ELISA方法检测母乳中的sIgA。将NLR、年龄、BMI、母乳天数、产次、早产、生产方式、平均每日蛋白质摄入量、平均每日能量摄入量和体力活动纳入多变量线性回归模型。结果本研究共有206名产妇纳入分析,此次收集的母乳中位天数及四分位数间距[P25,P75]为44.0[42.0,49.0]d,孕早期NLR中位水平为2.9[2.2,3.5],最小值1.3,最大值6.8;母乳中的sIgA平均浓度为(1798.1±213.0)μg/ml。NLR、年龄、母乳天数、产次和经能量调整的平均每日蛋白质摄入量是母乳中sIgA浓度的影响因素。NLR每增加1,母乳中的sIgA浓度升高32.6μg/ml。敏感性分析显示,剔除中性粒细胞和淋巴细胞5%的偏高值后,NLR仍与sIgA浓度呈正相关。结论母体孕早期NLR水平与成熟乳中的sIgA浓度呈正相关。

阴离子交换色谱法一步分离牛初乳中的sIgA

利用强碱3#树脂阴离子交换色谱法从牛初乳中分离获得分泌型免疫球蛋白A。考察了缓冲液pH和离子强度对所获免疫球蛋白A产品纯度的影响,获得从牛初乳中分离免疫球蛋白A的最优条件为pH7.0,离子强度为0.03mol/L的磷酸盐缓冲液,最终可获得纯度为91.24%的免疫球蛋白A,回收率达到47%。因此,利用以强碱3#树脂为基质的阴离子交换色谱分离牛初乳中的免疫球蛋白A具有很好的发展潜力。

血清IL-6,IL-8与宫颈sIgA联合检测对女性慢性盆腔炎的诊断价值研究

目的探究血清白介素(interleukin,IL)-6、IL-8与宫颈分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)联合检测对女性慢性盆腔炎的诊断价值。方法收取2014年5月—2017年12月在鄂州市中心医院经腹腔镜确诊为慢性盆腔炎的女性患者130例为病例组,与同期在该院行体检的健康女性150例为对照组,比较2组女性的血清IL-6、IL-8与宫颈sIgA水平,分析3者表达水平与慢性盆腔炎患者临床病例特征之间的关系。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic,ROC)分析血清IL-6、IL-8与宫颈sIgA对女性慢性盆腔炎的诊断价值,多元Logistic回归计算3者预测女性慢性盆腔炎发病的风险比(oddsratio,OR)及95%置信区间(confidence interval,CI)。结果与对照组比较,病例组女性的血清IL-6、IL-8与宫颈sIgA水平升高,差异比较具有统计学意义(t=3.967,P=0.003;t=4.013,P<0.001;t=2.986,P=0.002)。血清IL-6、IL-8在输卵管炎中增高最为显著,而宫颈sIgA在子宫体炎中增高最为显著。ROC结果表明,血清IL-6、IL-8与宫颈sIgA鉴别诊断女性慢性盆腔炎的灵敏度/特异性分别为84.9%/73.7%、77.5%/81.3%和38.9%/92.3%;诊断界值分别为:94.6pg/mL、88.6pg/mL和70.2μg/mL;联合3项指标的灵敏度为82.8%,特异度为93.6%。多元Logistic回归分析表明,高IL-6、IL-8、sIgA水平均是女性慢性盆腔炎发病的独立危险因素。结论联合血清IL-6,IL-8与宫颈sIgA3项指标可协助女性慢性盆腔炎的诊断,同时,3者对女性慢性盆腔炎发病风险的预测也具有潜在价值。

唾液SIgA、溶菌酶含量与慢性支气管炎关系的探讨

目的:探讨了慢性支气管炎患者唾液SIgA和溶菌酶含量的变化及临床意义。方法:应用放射免疫分析检测38例慢性支气管炎患者唾液SIgA含量,免疫扩散法测定溶菌酶含量,并与35名正常人作比较。结果:慢性支气管炎患者唾液SIgA和溶菌酶含量非常显著地高于正常人组(P<0.01),经2周治疗后仍有显著性差异(P<0.05)。结论:检测慢性支气管炎患者唾液SIgA和溶菌酶含量的变化对临床观察预后有重要的临床价值。

猪SIgA分泌片的表达及其多克隆抗体的制备

SIgA是评价黏膜免疫的重要指标,分泌片(SC)是SIgA的特有成分,为了更方便的获得大量的SIgA的分泌片,本研究应用RT-PCR方法扩增出SC基因片段,将SC基因片段克隆到pGEX-4T-1原核表达载体上,经酶切和测序验证获得pGEX-4T-1-SC重组质粒;将获得的pGEX-4T-1-SC转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达重组蛋白rSC.重组蛋白rSC经鉴定和纯化后,按常规免疫程序制备多克隆抗体;利用Western blot对抗重组蛋白rSC的多克隆抗体进行鉴定.结果显示,该抗体能特异性识别猪初乳中的SIgA免疫球蛋白,而与猪初乳中的IgG不发生反应.因此,抗SC重组蛋白的多克隆抗体可以作为抗SIgA免疫球蛋白的特异性抗体,为进一步建立SIgA的检测方法及黏膜免疫的研究奠定基础.

初乳口腔涂抹在早产儿中的应用效果

目的探讨初乳口腔涂抹在早产儿中的应用效果。方法选取2019年1月—2021年11月萍乡市人民医院新生儿科诊治的50例早产儿作为研究对象,采用随机数字表将其分为对照组(25例)与观察组(25例)。对照组未予初乳口腔涂抹,观察组给予初乳口腔涂抹。对比两组出生第1天、第7天的血清学相关指标[分泌型免疫球蛋白A(SIgA)、乳铁蛋白(LTF)]与7 d内感染发生率。结果两组早产儿出生第1天的SIgA、LTF水平相比,差异无统计学意义(P>0.05);对照组早产儿出生第7天的SIgA、LTF水平低于出生第1天,观察组早产儿出生第7天的SIgA、LTF水平高于出生第1天,且观察组早产儿出生第7天的SIgA、LTF[(11.48±1.41)μg/mL、(1070.90±90.29)μg/mL]水平均高于对照组[(8.77±0.79)μg/mL、(844.24±87.90)μg/mL],差异有统计学意义(P<0.05);出生7 d内,观察组感染发生率[16.00%(4/25)]与对照组[40.00%(10/25)]比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论初乳口腔涂抹能够有效提高早产儿机体的SIgA、LTF水平,使早产儿获得良好的营养支持与免疫保护,减少感染发生率。

半胱胺对鸡小肠粘膜中分泌型IgA细胞和上皮内淋巴细胞的影响

实验组肉鸡在灌喂半胱胺 2 0mg·kg-1(CY Ⅰ )和 80mg·kg-1(CY Ⅱ )后 ,应用鸡新城疫弱毒苗 (NDV) (Ⅳ系苗 )以口腔注入法进行免疫 ,检查小肠粘膜中分泌型免疫球蛋白A (sIgA)阳性细胞和上皮内淋巴细胞 (iIEL)数量的变化。结果表明 ,CY Ⅰ在NDV首免后第 4周 ,十二指肠中sIgA阳性细胞数量极显著增加 (P <0 0 1) ;CY Ⅰ和CY Ⅱ组在NDV首免后第 4周iIEL数量显著增加 (P <0 0 5 ) ;首免后第 5周CY Ⅰ组十二指肠中iIEL数量显著增加 (P <0 0 5 ) ;而盲肠扁桃体中这两种细胞数量的变化不大。提示生长抑素 (SS)可抑制小肠粘膜中sIgA阳性细胞和iIEL的分化和增殖 ,半胱胺通过耗竭鸡小肠中SS的含量可提高鸡的粘膜免疫力。

白细胞介素4对受照小鼠小肠粘膜免疫功能的促恢复作用

采用光镜、免疫酶联吸附实验、免疫组化、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR )等方法,观察了小鼠受8Gy^(60)Coγ射线全身1次性照射后,肠道粘膜免疫功能损伤机理及其调控的措施。结果表明,射线可直接损伤肠道淋巴细胞,导致肠道固有层中分泌免疫球蛋白A的浆细胞数量减少。同时,射线还能抑制肠道淋巴组织中调控免疫球蛋白M型B淋巴细胞向免疫球蛋白A型B淋巴细胞转化的白细胞介素-4基因表达,使分泌免疫球蛋白A的细胞进一步减少,从而使小肠粘液中分泌性免疫球蛋白A含量明显减少。用重组人白细胞介素4调控后,肠道固有层中浆细胞的数量明显增加,提高粘液中分泌性免疫球蛋白A的含量,对放射损伤后肠道粘膜免疫功能的恢复有一定防治作用。

分泌型免疫球蛋白A的研究进展

大部分感染都起源于黏膜表面,而黏膜免疫的主要抗体是分泌型免疫球蛋白A(SIgA),它能有效地阻断病原体的感染和侵入。SIgA是由1个IgA二聚体、1条J链和1个分泌片(SC)共价结合构成的异源十聚体。IgA和J链由活化B细胞产生,SC则由黏膜上皮细胞合成。SIgA分子具有极高的稳定性和极强的抗微生物活性。我们就SIgA合成的相关机制、IgA单体和SIgA的结构与功能,以及重组SIgA的研究进展简要综述。

SC结构、功能及其临床研究进展

分泌型免疫球蛋白A(SIgA)被认为是免疫防御中的第一道防线在黏膜免疫中发挥至关重要的作用,由2个单体IgA、1分子J链和1分子分泌成分(SC)组成.SC是多聚免疫球蛋白受体(pIgR)的胞外段部分,作为SIgA的重要组成部分,不仅在SIgA的转运、形成中发挥重要作用,而且可以保护SIgA的铰链区及增强其抗感染活性.因此关于SC的研究日益受到学者们的青睐,近年来有关SC的结构、功能及其在临床中的研究已经取得较大进展.

慢性细菌性前列腺炎局部免疫状况对预后的影响

为探讨前列腺局部免疫状况与病情及疗效的关系，将已确诊的慢性细菌性前列腺炎患者58例，根据病情不同分为A、B两组（分别为36例、22例），健康人20例为C组，采用放射免疫（双抗体—聚乙二醇）法，检测SIgA。结果：A组的SIgA（261.26±46．48μg／ml）高于C组（107.95±28．41μg／ml，P＜0.01）；B组SIgA（43.01±12.87μg／ml）低于C组（P＜0.01），提示前列腺液SIgA的含量可反应前列腺局部的免疫状况；A组患者的疗效（91.8％）高于B组（50.0％）；提示慢性细菌性前列腺炎的疗效与前列腺局部免疫状况有关。