FSH对体外培养仔猪睾丸支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的影响

【目的】确定FSH是否能调节支持细胞cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达及可能的机制。【方法】以培养的仔猪睾丸支持细胞为试验材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR检测cyclinD1 mRNA和cyclin E1 mRNA的相对表达量。【结果】不同浓度的FSH(0—100 ng.mL-1)均可促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),在FSH浓度为50 ng.mL-1时两种基因的表达量最大(P<0.05);FSH(50 ng.mL-1)也以时间依赖的方式促进了cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),在作用30 min时其表达量达到高峰(P<0.05)。不同浓度的Foskolin(0—20μmol.L-1)均可以促进cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),但均低于FSH单独作用时两种基因的表达量;Rp-cAMP(0—40μmol.L-1)、H-89(0—30μmol.L-1)和Verapamil(0—100μg.mL-1)以剂量依赖的方式抑制了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),而且Rp-cAMP和Verapamil联合作用对FSH的抑制效果高于单独的抑制效果(P<0.05),但低于两者之和。此外,不同浓度的U0126(0—10μmol.L-1)降低了FSH诱导的cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达(P<0.05),而Rp-cAMP、H-89、Verapamil和U0126单独作用时,cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA的表达与对照相比没有显著差异(P>0.05)。【结论】FSH以剂量依赖和时间依赖的方式诱导了cyclin D1 mRNA和cyclinE1 mRNA的表达;cAMP-PKA、Ca2+和ERK1/2参与了FSH对cyclin D1 mRNA和cyclin E1 mRNA表达的调节。

FSH和17β-雌二醇联合作用对CyclinD1mRNA和CyclinE1mRNA表达的影响

为了确定FSH和雌激素联合作用对培养条件下未成熟仔猪睾丸支持细胞中Cyclin D1mRNA和Cyclin E1mRNA表达的影响。以培养的仔猪睾丸支持细胞为研究材料,通过添加各种信号通路的抑制剂,应用实时荧光定量PCR检测Cyclin D1mRNA和Cyclin E1mRNA的相对表达量。FSH(50ng·mL-1)和17β-雌二醇(10-9 mol.L-1)联合作用时对Cyclin D1mRNA和Cyclin E1mRNA表达的影响与FSH或17β-雌二醇(10-9 mol.L-1)单独作用相比无显著影响(P>0.05);环磷酸腺苷抑制剂(Rp-cAMP)、L-Ca2+离子通道抑制剂(Verapamil)和ERK1/2抑制剂(U0126)单独作用时对Cyclin D1mRNA和Cyclin E1mRNA表达与空白对照组相比无显著影响(P>0.05),但以剂量依赖的方式抑制了FSH(50ng·mL-1)与17β-雌二醇(10-9 mol.L-1)联合作用对Cyclin D1mRNA和Cyc-lin E1mRNA的表达(P<0.05)。FSH和17β-雌二醇联合作用时通过cAMP、Ca2+内流和ERK1/2途径参与了FSH和17β-雌二醇对Cyclin D1mRNA和Cyclin E1mRNA在细胞中的表达。

牦牛Cyclin D1基因的克隆及IGF-I对其在睾丸支持细胞表达的影响

本研究旨在克隆牦牛(Bos grunniens)Cyclin D1基因的CDS序列,分析其生物学特性,研究胰岛素样生长因子-I(Insulin-like growth factor-I,IGF-I)对Cyclin D1mRNA和蛋白在睾丸支持细胞(Sertoli cell,SC)中表达的影响。采集5~8月龄健康牦牛的睾丸样品进行SC的分离培养,用RT-PCR技术克隆牦牛Cyclin D1基因,用ORF Finder、MEGA7.0和DNAMAN对其进行生物信息学分析,并采用免疫荧光染色技术对Cyclin D1蛋白在SC中的表达进行定位分析。向体外培养的SC中加入不同浓度(0(对照组)、25、50、100、150ng·mL^(-1))的IGF-I,采用实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹法检测Cyclin D1基因和蛋白的表达。结果表明:1)牦牛Cyclin D1基因(GenBank登录号:KY 420723)与其他物种的同源性均较高。2)Cyclin D1蛋白在SC胞核中高表达,为核蛋白。3)浓度为25和150ng·mL^(-1)IGF-I,Cyclin D1mRNA表达量与对照组差异不显著(P>0.05),浓度为50和100ng·mL^(-1)IGF-I时,Cyclin D1mRNA表达量显著高于其他各组(P<0.05);IGF-I浓度为100ng·mL^(-1),Cyclin D1蛋白表达量与对照组差异不显著(P>0.05),25、50和150ng·mL^(-1) IGF-I组Cyclin D1蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);IGF-I浓度为50ng·mL^(-1)时,Cyclin D1mRNA和蛋白表达量均为最高,分别为对照组的1.65和1.20倍。综上表明,Cyclin D1基因在进化过程中高度保守;IGF-I可调控SC中Cyclin D1的表达,其最佳作用浓度为50ng·mL^(-1)。