肠出血性大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素A亚单位单克隆抗体S1D8的制备和初步应用

目的:制备肠出血性大肠杆菌(EHEC)Ⅱ型志贺毒素(StxⅡ)A亚单位单克隆抗体,探讨用特异性抗体检测EHEC志贺毒素的可行性。方法:通过基因工程操作制备了EHEC StxⅡA亚单位蛋白-StxⅡA,StxⅡA免疫小鼠制备鼠源单克隆抗体;对获得的抗体S1D8克隆的特异性用Western blot验证;最后用单抗S1D8制备亲和层析柱纯化StxⅡ,用志贺毒素检测试剂盒验证其特异性。结果:成功表达、纯化StxⅡA-GST融合蛋白;从融和的杂交瘤中筛选出一株特异性抗体克隆并命名为S1D8,S1D8在Western blot中可以与StxⅡ的A亚单位特异性结合,用S1D8亲和层析柱从EHEC的培养上清液中纯化了StxⅡ,在胶体金检测试验中StxⅡ阳性。结论:单克隆抗体S1D8的制备为基于毒素分子作为靶分子的EHEC免疫诊断、治疗研究奠定了基础。

抗志贺毒素ⅡB亚单位单克隆抗体识别表位的初步鉴定

目的初步确定抗志贺毒素ⅡB亚单位(Stx2B)单克隆抗体(McAb)1H9、1H10、3E5识别的抗原表位。方法运用DNAstar Protean软件,对Stx2B(1～72aa)全抗原进行表位预测;采用截短法分段构建重组质粒Stx2B50(23～72aa),Stx2B54(1～54aa)。用IPTG诱导表达融合蛋白。对表达产物进行SDS-PAGE蛋白电泳及Westernblot分析。结果1H9、1H10能够识别Stx2B和Stx2B50;3E5能够识别Stx2B、Stx2B50和Stx2B54。结论McAb1H9、1H10识别的抗原表位位于55～72aa,McAb3E5识别的抗原表位位于23～54aa。

志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及其应用

应用淋巴细胞杂交瘤技术，获得１株针对志贺氏菌样毒素Ⅱ型变异体（ＳｈｉｇａｌｉｋｅｔｏｘｉｎⅡｖａｒｉａｎｔ，ＳＬＴⅡｖ）Ａ亚基单位的杂交瘤细胞，并建立了以硝酸纤维素膜为载体的菌落ＥＬＩＳＡ法。用此法检测１５株分离自猪水肿病的野毒菌株和３株产其它型ＳＬＴ的标准菌株，发现该单克隆抗体与１４株野毒菌株呈阳性反应，与产ＳＬＴⅡ的９３３Ｗ株菌有微弱交叉反应，但与产ＳＬＴⅠ和ＶＴ２的菌株（Ｈ３０和Ｅ３２５１１）均无反应。这表明该法能特异、敏感、简便、快速地鉴定产ＳＬＴⅡｖ的大肠埃希氏菌。

Ⅱ型志贺样毒素B亚单位的重组表达及其受体结合活性

目的:在大肠杆菌中重组表达Ⅱ型志贺样毒素B亚单位(Stx2B),并对其表达形式和受体结合活性进行分析。方法:PCR方法从肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7中钓取Stx2B编码基因,利用基因克隆技术构建重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21,IPTG诱导目的蛋白高效表达并对表达的包涵体进行变性和复性处理,离子交换层析纯化蛋白。通过SDS-PAGE变性和非变形蛋白电泳,分析重组Stx2B的表达形式,并利用Hela细胞结合模型,评价重组Stx2B与细胞受体的结合活性。结果:构建的重组大肠杆菌pET-stx2B/BL21能高效表达Stx2B,经变性、复性及离子交换层析操作,获得高纯度的目的蛋白。SDS-PAGE变性和非变形蛋白电泳分析显示,重组Stx2B以二聚体形式存在,单体之间通过二硫键相连。细胞结合试验显示,重组Stx2B与Hela细胞具有特异结合活性。结论:成功构建表达Stx2B的基因工程菌,Stx2B的受体结合活性不依赖于五聚体形式。

应用双抗体夹心ELISA检测产志贺毒素大肠杆菌Ⅱ型志贺毒素

目的：构建双抗体夹心ELISA检测Ⅱ型志贺毒素（ StxⅡ）,以利于产志贺毒素大肠杆菌（ STEC）感染的临床快速诊断。方法应用业已制备的StxⅡ特异性杂交瘤细胞株,筛选、鉴定最佳抗体配对,构建双抗体夹心ELISA检测体系,对16株STEC临床分离株培养上清中StxⅡ进行检测,并对该体系的特异性和敏感性进行评价。结果从获得的多株单抗分子中,成功筛选出最佳配对抗体S2D8和S2C6,构建基于S2D8/S2C6的双抗体夹心ELISA检测体系,该体系对StxⅡ纯品的检测底限是4 ng/ml,并成功从STEC培养上清中检测出StxⅡ及其变种,而与StxⅠ不结合。其检测效能与商业化胶体金试剂一致,显示出良好的敏感性和特异性。结论 S2 D8/S2 C6单抗的双抗体夹心法ELISA检测试剂的制备为基于毒素分子作为靶分子的STEC 免疫诊断、治疗研究提供基础资料。

EHEC O157：H7志贺毒素Ⅱ型A、B亚单位的表达及功能鉴定

目的克隆、表达肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157：H7志贺毒素（Shigatoxin，Stx）Ⅱ型A、B亚单位，并鉴定其免疫学功能。方法从EHECO157：H7基因组中克隆编码StxⅡ型A、B亚单位的基因，经测序、酶切后，导人表达载体pGEX-4T-2，转化大肠杆菌Top10F′，经诱导、纯化得到谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）-A和GST-B融合蛋白。分别用A、B亚单位融合蛋白免疫BALB／c小鼠获得高免血清，观察A、B亚单位血清对小鼠进行毒素攻击的保护作用。结果StxⅡ型A、B亚单位的GST融合蛋白获得高效表达并纯化；A、B亚单位的高免血清可以保护小鼠对致死量毒素的攻击。结论StxⅡ型A、B亚单位蛋白可以作为EHECO157：H7疫苗的候选分子，同时针对A、B亚单位蛋白的中和单抗可以对易感人群起到紧急保护作用。

时间分辨荧光免疫分析法检测产志贺毒素大肠杆菌

目的基于时间分辨荧光免疫分析技术,建立高灵敏性、高特异性的产志贺毒素II(StxⅡ)大肠杆菌(STEC)全自动超微量检测方法。方法以StxⅡ单克隆抗体S1D8包被96孔板,采用双功能螯合剂异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合Eu3+标记StxⅡ单克隆抗体S2C4,以β-二酮体为主的增强液为发光增强系统。建立StxⅡ双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法,并其对特异性、检出限、健全性进行评估。结果建立以StxⅡ为靶标的时间分辨荧光免疫法检测STEC法,检出限为0.023μg/L,与产StxI的STEC无交叉反应;平均回收率为98.95%,批内、批间CV分别为3.5%和4.7%。该方法灵敏性和特异性分别为100.0%和97.4%,阳性预测值和阴性预测值各是92.6%和100.0%,误诊率和漏诊率则分别是2.6%和0,假阳性率和假阴性率分别是2.6%和0。TRFIA检测StxⅡ毒素的诊断符合率为98.1%;约登系数为0.974,Kappa检验u系数为0.95。结论 StxⅡ时间分辨荧光免疫分析法灵敏度高、稳定性好,具有很好的临床应用前景。