肠出血性大肠杆菌O157：H7志贺样毒素2B亚基的表达

目的:克隆肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶H7 AH07株志贺样毒素2B(Stx2B)亚单位基因,应用原核表达系统制备重组蛋白质。方法:根据靶基因序列设计特异性寡核苷酸引物,采用PCR法克隆EHEC AH07株Stx2B的编码基因stx2b,靶基因经TA克隆后连接到表达载体pET-28a构建重组质粒,阳性重组子转化表达宿主菌E.coliBL-21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,应用SDS-PAGE和Western-blot(WB)分析重组蛋白生物活性。结果:PCR扩增stx2b基因约220 bp,成功构建重组质粒pET28a-stx2b,并在原核细胞中得到高效表达,目的蛋白质的相对分子质量约为7500,约占蛋白质总量的40%;WB显示目的蛋白质可与特异性抗体发生特异性反应。结论:成功克隆EHEC O157∶H7stx2b基因,在原核系统获得目的蛋白质的高效表达,为O157∶H7感染机制及疾病诊断和疫苗研究奠定基础。

霍乱毒素B亚单位与志贺毒素2B亚单位融合表达及抗原性检测

目的克隆表达出血性大肠埃希菌（EHEC）O157：H7志贺毒素2B亚单位（Stx2B）与霍乱毒素B亚单位（CTB）的融合蛋白（CTB-Stx2B），并检测其抗原性和与神经节苷脂（GM1）结合能力。方法设计引物扩增融合蛋白CTB—Stx2B的编码基因ctb-stx2b，T-A克隆测序验证后克隆入原核表达质粒pET30a（＋）C，构建表达质粒pET30a（＋）-ctb-stx2b，转化E．coliBL21（DE3），IPTG诱导表达、纯化，获得目的蛋白CTB-Stx2B，SDS-PAGE和Western-blot检测其抗原性和形成五聚体的能力；GMI-ELISA法检测其与GM1结合能力。结果扩增出约750bp的目的片段，测序鉴定与设计序列一致；原核表达质粒pET30a（＋）-ctb-stx2b转化E．coliBL21（DE3）后，经酶切和PCR扩增鉴定正确；IPTG诱导后SDS-PAGE初步测定CTB-Stx2B单体的相对分子质量（Mr）约为20×10^3；Western-blot检测CTB-Stx2B能与CTB单克隆抗体结合，纯化产物经复性后大多以五聚体形式存在；ELISA检测CTB-Stx2B具有结合GM1活性。结论成功克隆、表达了融合蛋白CTB-Stx2B；表达的蛋白具有良好的CTB抗原性和GM1结合能力。

肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠的实验研究

目的研究肠出血性大肠杆菌O157：H7基因工程疫苗免疫小鼠后对该菌感染的保护能力。方法将60只BALB／c小鼠平均分为5组，分别为3种抗原单独免疫、三抗原联合免疫和PBS对照组，用注射方式免疫3次，抗原和佐剂均为每次100μg／只。采集免疫前和各次免疫后7d的小鼠血清检测抗体，末次免疫10d后以10^9CFU的O157全菌液经口感染小鼠。观察小鼠临床症状及死亡情况，检测粪便与肠道带菌情况，并作病理组织学检测。结果各抗原免疫组小鼠特异抗体明显增加，感染后各组小鼠均有死亡，IntiminC300、Stx2B、HlyAN436和联合免疫组保护率分别为73％、64％、36％和91％。未病死小鼠粪便排菌情况：对照组22d，实验组为5—14d。肠道带菌情况：对照组阳性率为100％，实验组为25％-83％。病死小鼠肺脏、肝脏均有明显组织病理学改变。结论IntiminC300、Stx2B和HlyAN436疫苗对于O157感染具有一定的预防作用，而联合免疫效果又大于单独免疫。