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Molecular Cloning and NucleotideSequence of Classical SwineFever Virus Strain Shimen 被引量:1
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作者 Huang Qianhua Zhang Chuyu +2 位作者 Wang Jiafu Wang Ning Fu Liezhen(College of Life Sciences, Wuhan University, Wuhan, 430072,China) 《Wuhan University Journal of Natural Sciences》 CAS 1998年第4期504-508,共5页
According to the previously published CSFV sequences, 18 paris of partially overlapping primers which span the entire genome of CSFV strain Shimen were designed and synthesized. Each cDNA fragment of strain Shimen was... According to the previously published CSFV sequences, 18 paris of partially overlapping primers which span the entire genome of CSFV strain Shimen were designed and synthesized. Each cDNA fragment of strain Shimen was amplified by RT-PCR method from the anticoagulant blood of strain Shimen infected pig. The PCR fragments were cloned into pGEM-T vector respectively and sequenced. The results show that we have obtained the nucleotide sequence of strain Shimen. The viral RNA consists of 12 297 nucleotides including noncoding regions of 373 and 227 bases at the 5′ and 3′ end, respectively, and a single large open reading frame spanning 11 697 nucleotides in the middle, which encodes an amino acid sequence of 3 989 residues with a calculated molecular weight of 437.6×103. The precisely sequencing of 5′ and 3′ termini is undertaking. 展开更多
关键词 Key words classical swine fever virus strain shimen CLONING SEQUENCING
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猪瘟单克隆抗体的制备及ACI-ELISA检测猪瘟病毒的研究 被引量:10
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作者 陆芹章 罗廷荣 +2 位作者 温和心 蒋毅立 谢琪辉 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2004年第5期368-372,共5页
本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CSFv E2蛋白的McAb。用AC9和CF8McAb... 本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CSFv E2蛋白的McAb。用AC9和CF8McAb对CSFV进行抗原捕获间接ELISA试验(ACI-ELISA),通过一元McAb和二元McAb CAI-ELISA试验的比较,结果表明AC9与CF8两种McAb有协同作用,其捕获CSFV的能力比一元McAb显著提高。方阵试验结果表明:McAb和血清多抗(PcAb)的最佳工作稀释度分别为1:400和1:200。特异性试验和敏感性试验结果显示本法特异性强,敏感性高。最后用ACI-ELISA与PCR对30份病料的检测结果比较,表明ACI-ELISA与PCR检测结果相符。上述结果说明本研究所获得AC9和CF8可用作猪瘟诊断试剂盒的研制,是检测CSFV的有效方法。 展开更多
关键词 猪瘟石门毒 单克隆抗体 制备 抗原捕获间接ELISA试验
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猪瘟病毒石门株不同代次E2基因主要抗原编码区序列差异分析 被引量:7
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作者 赵耘 王在时 +2 位作者 王琴 李博 丘惠深 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2002年第7期7-10,共4页
利用 RT- PCR及序列测定对猪瘟病毒石门株不同代次毒株 E2基因主要抗原编码区及同一代次不同年代主要抗原编码区序列进行了分析 ,结果所有毒株 E2基因主要抗原编码区序列呈现较高的同源性 ,石门株不同代次毒株 E2基因主要抗原编码区核... 利用 RT- PCR及序列测定对猪瘟病毒石门株不同代次毒株 E2基因主要抗原编码区及同一代次不同年代主要抗原编码区序列进行了分析 ,结果所有毒株 E2基因主要抗原编码区序列呈现较高的同源性 ,石门株不同代次毒株 E2基因主要抗原编码区核苷酸及氨基酸同源性分别为 97.7%~ 10 0 %、97.3%~ 10 0 % ;同一代次不同年代主要抗原编码区序列核苷酸及氨基酸同源性均为 98.6 %~ 10 0 %。只有 3个代次毒株发生较小的变异 ,核苷酸及氨基酸呈现 1~ 3个碱基或氨基酸的变异 ,其他代次的毒株序列完全一致。初步证实了猪瘟病毒分子结构的遗传稳定性 。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 石门株 代次 E2基因 抗原编码区 序列差异分析 同源性 遗传稳定性
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猪瘟病毒及其全长cDNA在猪肾细胞中增殖表达特性的比较研究 被引量:5
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作者 田宏 张彦明 +5 位作者 林彤 刘湘涛 胡建和 吴锦艳 张淼涛 谢庆阁 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第10期1038-1042,共5页
以猪瘟C-株弱毒疫苗株、经典强毒石门株和C-株全长cDNA为试验材料,以免疫荧光技术为主;结合ELISA和RT-PCR检测技术,对其在培养细胞中的增殖特性和表达规律进行了比较研究。同时筛选猪瘟病毒及其全长cDNA的敏感细胞,探索其增殖表达规律,... 以猪瘟C-株弱毒疫苗株、经典强毒石门株和C-株全长cDNA为试验材料,以免疫荧光技术为主;结合ELISA和RT-PCR检测技术,对其在培养细胞中的增殖特性和表达规律进行了比较研究。同时筛选猪瘟病毒及其全长cDNA的敏感细胞,探索其增殖表达规律,以便为猪瘟病毒反向遗传操作提供技术方法和可操作的条件。 展开更多
关键词 猪瘟病毒C-株 石门株 全长cDNA细胞转染 细胞转染鉴定
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猪瘟病毒石门株E2基因的RT-PCR克隆及鉴定 被引量:3
5
作者 王宁 张楚瑜 +1 位作者 朱燕 付烈振 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 1999年第1期8-9,共2页
本文采用RT-PCR技术从感染猪血中成功扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株E2基因,大小为1184bp,与预期大小一致。经巢式PCR和酶切鉴定证实所扩增的片段为E2基因特异性片段。将扩增的E2基因克隆到PGEM-T载体,采... 本文采用RT-PCR技术从感染猪血中成功扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株E2基因,大小为1184bp,与预期大小一致。经巢式PCR和酶切鉴定证实所扩增的片段为E2基因特异性片段。将扩增的E2基因克隆到PGEM-T载体,采用限制性内切酶鉴定和PCR技术鉴定出了阳性重组子。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 石门株 RT-PCR E2基因 克隆
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猪瘟病毒石门株NS2-3基因片段的序列测定及比较 被引量:2
6
作者 黄茜华 张楚瑜 +2 位作者 王宁 傅烈振 王家富 《中国病毒学》 CSCD 1999年第2期163-168,共6页
根据猪瘟病毒C株的序列,以计算机辅助设计,化学合成1对引物(PF5648/PR6604),应用RTPCR技术从感染猪血中成功地扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株NS23基因片段,大小为957bp,位于NS3基因的中部N... 根据猪瘟病毒C株的序列,以计算机辅助设计,化学合成1对引物(PF5648/PR6604),应用RTPCR技术从感染猪血中成功地扩增了我国猪瘟病毒强毒石门株NS23基因片段,大小为957bp,位于NS3基因的中部NTPase和Helicase活性区。克隆后测序,结果表明该段基因产物具有解旋酶超家族全部七个特征性保守序列,包括共同的NTP结合基序A位点(GXGKT/S)和B位点(3hy,2x)D。序列同源性比较表明,石门株与日本的ALD和GPE-株同源性最高,与其它3株猪瘟病毒(C株、Brescia株和Alfort株)的同源性也很高,并与2株牛病毒性腹泻病毒(BVDV)(NADL株和SD1株)也有较高的同源性,尤其是由核苷酸序列推导的氨基酸序列,同源性均大于90%,是瘟病毒属基因组中最保守的区段。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 石门株 NS2-3基因片段 序列分析
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猪瘟病毒石门株NS4A基因的克隆、测序及分析 被引量:1
7
作者 黄茜华 张楚俞 《微生物学杂志》 CAS CSCD 1999年第2期5-7,共3页
采用RT-PCR技术,利用一对引物,从感染猪血中成功扩增了猪瘟病毒强毒石门株NS4A基因,片段大小为757bp,与预期大小一致。克隆后经酶切鉴定,自动化测序。序列比较表明,该基因为最保守的基因之一,其中石门株序列与ALD,GPE,HCLV及Br... 采用RT-PCR技术,利用一对引物,从感染猪血中成功扩增了猪瘟病毒强毒石门株NS4A基因,片段大小为757bp,与预期大小一致。克隆后经酶切鉴定,自动化测序。序列比较表明,该基因为最保守的基因之一,其中石门株序列与ALD,GPE,HCLV及Brescia株均有很高的同源性,由其推导的氨基酸的同源性高达100%。仅与Alfort株的同源性消低。对石门株序列与同属的BVDVSD-1株和NADL株序列进行了比较。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 石门株 NS4A基因 克隆 序列分析
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猪瘟病毒石门株E2基因的克隆及在大肠杆菌中的表达 被引量:1
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作者 王宁 张楚瑜 +1 位作者 付烈振 朱燕 《武汉大学学报(自然科学版)》 CSCD 1998年第2期259-261,共3页
采用RT-PCR技术扩增了猪瘟病毒石门株的E2基因.扩增片段大小为1184bp,与预期大小一致.经SacI酶切和巢式PCR证实了E2基因的特异性.将E2基因扩增片段首先克隆至pGEM-T载体中,进行全序列测定,将该基... 采用RT-PCR技术扩增了猪瘟病毒石门株的E2基因.扩增片段大小为1184bp,与预期大小一致.经SacI酶切和巢式PCR证实了E2基因的特异性.将E2基因扩增片段首先克隆至pGEM-T载体中,进行全序列测定,将该基因再克隆到表达载体pBV221.采用温控诱导,SDS-PAGE结果显示E2基因获得表达.ELISA表明E2基因表达产物可与猪瘟阳性血清起特异性反应. 展开更多
关键词 猪瘟病毒石门株 E2基因 克隆 表达 大肠杆菌
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猪瘟病毒p80基因丝氨酸蛋白酶功能区的原核表达及小鼠免疫试验
9
作者 鲁絮 许信刚 +2 位作者 张彦明 张淼涛 李少方 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2007年第6期14-18,共5页
根据已发表的猪瘟病毒Alfort株的全基因组序列,设计2对引物以Shimen细胞毒株为材料,一步法提取总RNA,利用RT-PCR和套式PCR,成功扩增出p80全长基因,包括丝氨酸蛋白酶以及NTPase/RNA解旋酶功能区,大小约为2.0kb。将p80基因中的丝氨酸蛋白... 根据已发表的猪瘟病毒Alfort株的全基因组序列,设计2对引物以Shimen细胞毒株为材料,一步法提取总RNA,利用RT-PCR和套式PCR,成功扩增出p80全长基因,包括丝氨酸蛋白酶以及NTPase/RNA解旋酶功能区,大小约为2.0kb。将p80基因中的丝氨酸蛋白酶基因克隆到原核表达载体pET-32a中,获得重组质粒pET-p80。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)中,IPTG诱导表达得到分子量约为43ku的目的蛋白,与理论大小相符。将菌体蛋白经Ni柱纯化,获得纯化重组p80蛋白,Western blot检测表明,表达的目的蛋白能与CSFV阳性血清发生反应。用纯化的p80蛋白免疫Bal b/c小鼠,成功制备了抗p80蛋白的抗血清。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 p80基因 原核表达 免疫
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猪瘟病毒E2基因的克隆及原核表达
10
作者 程晓盈 张彦明 +3 位作者 王(韦华) 邢福珊 郭抗抗 洪海霞 《西北农林科技大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2005年第12期13-16,共4页
利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱... 利用RT-PCR技术扩增出不含信号肽的猪瘟病毒石门株的E2基因,将其克隆到PGEX-T-Easy 载体上,用BamH Ⅰ和HindⅢ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因克隆到表达载体质粒pPROEX-HTb中,获得 重组质粒PPRO,EXE2,用pPROEXE2转化大肠杆菌,诱导含重组质粒PPROEXE2的大肠杆菌BL21表达E2基因蛋 白,研究E2蛋白与猪瘟阳性血清反应的特异性。结果表明,受体菌诱导后能表达E2基因蛋白,所表达的E2蛋白能 与猪瘟阳性血清发生特异性很强的反应。 展开更多
关键词 猪瘟病毒石门株 E2基因 克隆 表达
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猪瘟病毒(HCV)石门株部分p23和p14基因的克隆、序列测定及与其他HCV株的比较
11
作者 李红卫 涂长春 +4 位作者 吕宗吉 孙明 金扩世 余兴龙 殷震 《中国兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 1997年第6期526-529,共4页
应用RT-PCR扩增猪瘟病毒(HCV)石门株部分p23和p14基因,然后采用平端克隆法将扩增的cD-NA克隆到pUC19的SmaⅠ位点,用双脱氧终止法对重组质粒中的插入片段进行序列分析。将所测定的序列与其他10株HC... 应用RT-PCR扩增猪瘟病毒(HCV)石门株部分p23和p14基因,然后采用平端克隆法将扩增的cD-NA克隆到pUC19的SmaⅠ位点,用双脱氧终止法对重组质粒中的插入片段进行序列分析。将所测定的序列与其他10株HCV相同基因区域用DNASIS计算机软件进行同源性比较和系统树分析,结果表明,大部分毒株为同一个型,该型共包括9个HCV株,以Brescia株为代表,石门(Shimen)株也属该型;而Alfort株和P97株与上述9个毒株差异较大,不属同一型。 展开更多
关键词 猪瘟 病毒石门株 基因 克隆 序列分析
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猪瘟病毒石门株NS4B基因的序列测定及分析 被引量:1
12
作者 黄茜华 张楚瑜 《湖北农学院学报》 1999年第1期53-55,共3页
采用RT-PCR技术,利用2对引物,从猪瘟病毒(CSFV)强毒石门株感染的猪血中成功扩增了NS4B基因,片段大小分别为757bp和774bp。克隆后经酶切鉴定,自动测序和序列分析,结果显示该基因较为保守,与其他猪瘟病... 采用RT-PCR技术,利用2对引物,从猪瘟病毒(CSFV)强毒石门株感染的猪血中成功扩增了NS4B基因,片段大小分别为757bp和774bp。克隆后经酶切鉴定,自动测序和序列分析,结果显示该基因较为保守,与其他猪瘟病毒毒株均有很高的同源性,与同属的BVDVSD-1株和NADL株也有较高的同源性。 展开更多
关键词 猪瘟病毒石门株 NS4B基因 序列分析 猪瘟
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猪瘟病毒石门株NS5A基因的序列测定及同源比较
13
作者 黄茜华 张楚瑜 《华中农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 1999年第2期154-157,共4页
根据已发表的猪瘟病毒序列,设计并合成了3对引物,利用RTPCR技术,从猪瘟病毒石门株感染猪血中成功扩增了各cDNA片段,覆盖整个NS5A基因,片段大小各为774,685,917bp。克隆后测序。序列比较结果显示,该... 根据已发表的猪瘟病毒序列,设计并合成了3对引物,利用RTPCR技术,从猪瘟病毒石门株感染猪血中成功扩增了各cDNA片段,覆盖整个NS5A基因,片段大小各为774,685,917bp。克隆后测序。序列比较结果显示,该基因在CSFV中较为保守。与同属的BVDV的序列同源性较低,且氨基酸的同源性低于核苷酸的同源性,推测它参与决定瘟病毒种的特异性。 展开更多
关键词 猪瘟病毒石门株 NS5A基因 序列测定 同源比较
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猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR方法的建立 被引量:4
14
作者 王伟 邹月红 +6 位作者 李雪松 陈欣 郎越坤 田华斌 符芳 李曦 李集临 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2011年第3期104-107,共4页
为了能快速、准确地诊断猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)石门系强毒,根据登录在GenBank上23株Shimen毒株的全基因组序列,利用DNASIS软件进行序列分析,设计1对特异的荧光定量引物。建立猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法... 为了能快速、准确地诊断猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)石门系强毒,根据登录在GenBank上23株Shimen毒株的全基因组序列,利用DNASIS软件进行序列分析,设计1对特异的荧光定量引物。建立猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR快速检测方法。试验结果表明,本方法最低可检测到的Shimen病毒cDNA含量为100拷贝/μL,敏感度至少是普通PCR的100倍;猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、牛流行腹泻病毒Ⅰ型(BVDV-1)和猪瘟病毒C株均无特异性扩增,证明本方法具有很强的特异性;通过批内和批间重复试验,其变异系数<0.7%,结果显示本方法具有很好的重复性。本研究建立了猪瘟石门系强毒株SYBR Green-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR快速检测方法,为猪瘟的预防与控制提供了有效的技术手段,并为猪瘟强毒试剂盒的研发奠定了基础。 展开更多
关键词 猪瘟病毒 shimen毒株 SYBRGreen-Ⅰ染料法实时荧光定量PCR
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Construction of cDNA library, nucleotide sequence and analysis of entire genome of classical swine fever virus strain Shimen 被引量:1
15
作者 Qianhua Huang Chuyu Zhang +7 位作者 Jiafu Wang Liezhen Fu Ning Wang Yan Zhu Jisen Huai Pengwei Zhang Jianshi Yu Hui Xu 《Chinese Science Bulletin》 SCIE EI CAS 2000年第4期367-369,共3页
According to the previously published CSFV sequences, 18 pairs of primers have been designed and synthesized, which cover the entire genome of CSFV strain Shimen. Each cDNA fragment has been amplified by RT-PCR from t... According to the previously published CSFV sequences, 18 pairs of primers have been designed and synthesized, which cover the entire genome of CSFV strain Shimen. Each cDNA fragment has been amplified by RT-PCR from the anticoagulant blood of strain Shimen infected pig. The PCR products have been cloned respectively and sequenced. Results show that the cDNA library of strain Shimen and its nucleotide sequence have been obtained. The genomic RNA of strain Shimen is 12 298 nucleotides in length, containing a 5’ and a 3’ noncoding region 373 and 231 nt long respectively. The center of genome is a single large open reading frame of 11 697 nt which encodes a polyprotein of 3 898 amino acids. The entire sequence of strain Shimen has also been compared with that of other CSFV strains. 展开更多
关键词 : GENOME of classical SWINE FEVER virus strain shimen cDNA library CLONING SEQUENCING sequence analysis.
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