靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因的发卡样siRNA表达载体的构建及其效应

目的设计合成有效的靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因的发卡样siRNA(shRNA)表达载体。方法根据siRNA的设计原则,以血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1为靶基因设计并合成小发卡结构两端配对的siRNA寡核苷酸链,再经变性、复性后形成双链血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1shRNA。采用DNA重组技术,将血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1shRNA双链与线性化pGenesil-1质粒表达载体连接,脂质体法转染人脐静脉内皮细胞株,半定量逆转录聚合酶链反应法检测血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA的表达。结果测序鉴定发现插入的发卡样序列正确,成功合成了发卡样血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因RNA干扰表达载体;靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因的发卡样siRNA表达载体转染人脐静脉内皮细胞株后,其凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA的表达显著下调。结论成功构建了能有效抑制血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1mRNA表达的发卡样血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体1基因RNA干扰表达载体,为进一步利用RNA干扰技术防治动脉粥样硬化提供一种研究基础。

PCR扩增的shRNA表达盒快速筛选PRRSV有效siRNA序列

有效siRNA的筛选是RNAi研究的关键点之一。本研究选取猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的核衣壳蛋白(N)作为靶基因,使用http://www.ambion.com的靶位点筛选和设计工具,选取4个siRNA序列(siRNA95、siRNA179、siRNA218和siRNA294),利用一步PCR法产生包含U6启动子的短发夹RNA表达盒技术快速筛选高效siRNA,PCR法制备的shRNA表达盒(PCR-shRNA95、PCR-shRNA179、PCR-shRNA218和PCR-shRNA294)分别与表达N-EGFP融合蛋白的重组质粒pEN-ORF7共转染至293T细胞,48 h后荧光显微镜下检测细胞表达EGFP阳性率,筛选有效siRNA片段,将筛选的PCR-shRNA179的PCR产物转染N-EGFP融合蛋白稳定表达293T细胞系和PRRSV感染的Marc-145细胞,结果表明PCR-shRNA179可明显减少N蛋白的表达、有效减轻PRRSV引起的细胞病变及减少感染PRRSV的Marc-145细胞中的N蛋白阳性细胞。本研究证明一步PCR扩增shRNA表达盒法可用于筛选特异性基因表达抑制的siRNA。

烟草花叶病毒siRNA设计及其植物表达载体构建(英文)

RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究.本文分析烟草花叶病毒(TMV)基因序列,选择设计编码小分子发卡结构RNA(hpRNA)的cDNA;并根据农杆菌双元载体质粒p2355多克隆位点区限制性酶切位点,两端分别加入XbaI和BamHI酶切位点;分别合成单链DNA复性后插入到p2355上,经PCR、测序验证,表明已成功构建了具有潜在表达烟草花叶病毒siRNA的植物表达载体.

shRNA和siRNA敲降NET-1对A431细胞生物学行为影响的比较

目的:比较小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)和小发夹RNA(small hairpin RNA,sh RNA)敲降皮肤鳞癌细胞株(A431)中NET-1基因的表达,及其对癌细胞增殖、浸润的影响。方法:分别构建针对人NET-1基因的si RNA NET-1真核表达载体(p U6H1-GFP-si RNA NET-1,si RNA NET-1)和sh RNA真核细胞表达质粒(psilencer4.1-sh RNA NET-1,sh RNA NET-1),同时构建相应载体的随机序列(target-off)的对照质粒(sh RNA target-off和si RNA targetoff)。体外瞬时转染A431细胞,通过实时定量聚合酶链反应(real time quantitative polymerase chain reaction,RT-q PCR)、Western Blot分别检测癌细胞内NET-1 m RNA和蛋白的表达,免疫荧光染色在镜下观察NET-1蛋白在细胞内的表达;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]法和流式细胞术检测细胞增殖;划痕试验和Transwell试验分别检测A431细胞的迁移和侵袭能力,比较si RNA和sh RNA对NET-1基因的抑制效果。结果:测序证实编码NET-1序列的si RNA和sh RNA已经分别插入载体p U6H1-GFP和psilencer4.1的启动子之间,测序结果符合设计要求。转染si RNA NET-1和sh RNA NET-1后,均能显著下调A431细胞NET-1 m RNA和蛋白的表达水平,显著抑制A431细胞的增殖、迁移和浸润,与对照组(target-off)比较差异均有统计学意义(均P<0.005)。在细胞生长曲线分析中显示转染sh RNA NET-1组在72 h后抑制细胞增殖的效果强于si RNA NET-1组。结论:NET-1基因的功能与A431细胞增殖、迁移、浸润有关。靶向NET-1的si RNA和sh RNA真核表达载体均能特异、有效地下调NET-1基因的功能。sh RNA介导的RNAi作用能更长期、稳定的抑制目的基因的表达,更适合于对目的基因功能进行长期研究。

靶向X基因shRNA特异抑制HBV基因表达和复制

目的:研究针对HBV X基因小发夹RNA(shRNA)对HBV基因表达和复制的抑制作用。方法:利用分子克隆方法构建了4个HBV X基因特异性shRNA的表达质粒pshHBx1-4,与HBV复制性质粒共转染HepG2细胞,Northern和Southern印迹法检测HBV的mRNA和病毒复制中间体,化学发光微粒免疫分析方法检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg,免疫荧光染色分析细胞HBcAg的表达水平。结果:共转染pshHBx1-4显著抑制HBV mRNA表达、降低细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的水平和细胞内HBcAg的表达水平、并有效抑制HBV的病毒复制中间体的合成。结论:HBV X基因特异性的shRNA可以有效抑制HBV的基因表达和病毒复制,有可能发展成为新的抗HBV制剂。

LOX-1特异性小发夹RNA表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响

目的:靶向血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(LOX-1)基因的发卡样siRNA(shRNA)表达载体的构建及其对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的影响。方法:(1)采用DNA重组技术,将LOX-1shRNA双链与线性化pGenesil-1质粒表达载体连接,构建LOX-1特异性小发夹RNA表达载体pLOX-1-shRNA1及pLOX-1-shRNA2,用脂质体法转染小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7),半定量逆转录聚合酶链反应法检测LOX-1mRNA的表达,Western blot法检测LOX-1蛋白的表达,选择沉默效果最佳的作为下一步的干预序列。(2)ox-LDL诱导巨噬细胞建立泡沫细胞模型,pLOX-1-shRNA进行干预,干预组使用脂质体法进行细胞转染,转染24小时后,再加入ox-LDL作用24小时,用油红O染色法及细胞内游离胆固醇及总胆固醇测定法观察对泡沫细胞形成的影响,倒置荧光显微镜观察RAW264.7细胞对Dil-ox-LDL的摄取率。结果:测序鉴定发现插入的发卡样序列正确,成功合成了发卡样LOX-1基因RNA干扰表达载体,pLOX-1-shRNA1及pLOX-1-shRNA2转染RAW264.7细胞后,其LOX-1基因和蛋白表达显著下调,并且以pLOX-1-shRNA2沉默效果最佳。结论:成功构建了能有效抑制LOX-1基因及蛋白表达的干扰表达载体,同时可抑制巨噬细胞源性泡沫细胞形成及对Dil-ox-LDL的摄取,为进一步利用RNA干扰技术防治动脉粥样硬化提供理论基础。

Applications of RNA interference highthroughput screening technology in cancer biology and virology

RNA interference （RNAi） is an ancient intra-cellular mechanism that regulates gene expression and cell function. Large-scale gene silencing using RNAi highthroughput screening （HTS） has opened an exciting frontier to systematically study gene function in mammalian cells. This approach enables researchers to identify gene function in a given biological context and will provide considerable novel insight. Here, we review RNAi HTS strategies and applications using case studies in cancer biology and virology.