短雄花序板栗芽变的AFLP分析

利用AFLP分子标记技术对板栗短雄花序芽变及其母株进行了初步研究,72种引物组合共产生5129条清晰谱带,多态性位点53个,多态性2.05%,相似性系数0.9897,差异片段主要集中于300～900bp之间。研究表明短雄花序芽变和对照个体之间变异与遗传物质的改变相关,其中一些可能与雄花序变短的基因有关。

板栗短雄花序异常死亡的超微结构观察

板栗(Castanea mollissimaBl.)短雄花序发育过程中,花序上部变黄,弯曲,最后枯死脱落,而基部花序正常发育。利用透射电镜观察花序上部发育中的细胞超微结构发现:细胞呈现有序的死亡变化,细胞核内发生染色质凝聚,继而核仁消失,核质降解,核膜破裂,核解体;液泡内吞现象明显,形成很多小液泡;叶绿体和线粒体也逐渐解体;花序上部衰亡过程中所有细胞器在膜包裹下有序地降解,表现出植物细胞程序性死亡的典型形态学特征。

应用抑制性消减杂交分离板栗短雄花序芽变相关基因

利用抑制性消减杂交技术分离了板栗正常花序与芽变花序之间表达的差异cDNA片段。以芽变板栗雄花序cDNA为试验方(tester),以对照板栗雄花序cDNA为驱动方(driver),构建了一个板栗芽变花序消减文库。菌落PCR显示插入片段主要在100～1000 bp,文库质量良好。通过对文库阳性克隆随机测序共得到了30个有效EST序列。利用Blast同源性比较,其中一些EST可能与板栗雄花序发育中变短的生物学形态形成密切相关,为后续板栗短雄花序芽变相关基因的研究奠定了基础。

板栗短雄花序芽变的离体培养研究

试验以板栗短雄花序芽变为材料,研究了以MS为基本培养基,采取不同外植体、不同激素配比对其愈伤组织诱导的影响,结果表明,其最适宜的诱导培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。茎段、嫩叶两种外植体中,以其茎段培养的诱导率较高,成愈率为65.0%。继代培养的适宜培养基为MS+0.5-1.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA。

板栗短雄花序芽变花粉特性研究

本试验从花粉形态、花粉生活力、结实特性和花粉直感等方面对板栗短雄花序芽变进行研究。结果表明:短雄花序芽变、芽变母株和对照花粉中均未发现畸形花粉,芽变和对照花粉的形态相似,但芽变花粉的赤道轴长度明显短于对照花粉。芽变花粉生活力为31.0%,自花结实率为55.4%,均极显著低于对照。用芽变花粉为北京主栽品种燕红授粉后,结实率可达89.1%,其对总苞内坚果的粒数和单粒重有一定程度的花粉直感作用。

板栗短雄花序芽变的坚果营养成分分析

笔者研究板栗短雄花序芽变坚果的营养成分,包括总糖、蛋白质、脂肪、淀粉、维生素、氨基酸和矿质元素。结果表明:板栗芽变坚果的营养成分具有高蛋白低脂肪、高钾低钠、赖氨酸和组氨酸含量高的特点;短雄花序芽变坚果的总糖,VB2,VB3,VB6,VB9,VC,VE,Ca,Fe,Cu,Zn和16种氨基酸含量极显著高于对照燕山红栗(P<0.1)。

板栗酰基转移酶基因的克隆及其在短雄花序发育中的表达

板栗短雄花序有利于减少树体营养消耗。雄花短化的机理研究对新种质的培育与利用有重要意义。试验从发育中的板栗芽变短雄花序cDNA中获得一个酰基转移酶cDNA全长。该结构基因包括一个1 335bp的开放阅读框,编码一个含445个氨基酸的完整阅读框架,预测蛋白的相对分子质量约为49kD,无跨膜结构。通过实时荧光定量PCR分析发现该酶在正常花序和芽变花序发育过程中表达量存在差异,短雄花序顶端死亡脱落时该基因表达量显著高于正常雄花序。初步推断在短雄花序生长发育过程中,该酶参与了花序顶端细胞的程序性死亡过程,其较高的表达是造成雄花序顶端死亡的原因之一。

板栗芽变短雄花序发育的细胞形态学观察

本试验对板栗芽变短雄花序的生长动态、形态特征及细胞形态进行观察。结果表明:芽变雄花序长度和粗度生长缓慢,长度和直径都明显小于对照雄花序。通过细胞组织形态学观察,表明雄花序上部细胞发生异常死亡的时间在5月14日—5月16日之间,此期雄花序发育内部处于花被分化期,外部顶端开始变黄,并逐渐弯曲直至枯死,最终导致上部雄花序死亡。

赤霉素对板栗短雄花序表型恢复的效应

为研究赤霉素与板栗芽变雄花序短化的关系,以板栗短雄花序为材料,用IAA,CTK,GA3,GA4+7,IAA∶CTK=1∶1,GA3∶CTK=1∶1,GA3∶IAA=1∶1,处理短雄花序。结果表明单独使用GA3处理的恢复长度最好,平均长度为7.17 cm,恢复超过2 cm占60%。之后用HPLC法测定内源GA3的含量,结果表明GA3处理和GA4+7处理后的雄花序内源GA3的含量均显著高于对照。LC-MS法测定内源GA4含量表明,GA3处理和GA4+7处理后的雄花序内源GA4的含量均极显著高于对照。赤霉素可使短雄花序恢复伸长。

板栗赤霉素缺陷型短雄花序芽变的初步鉴定及CmGID1基因的表达分析

利用赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯利和吲哚乙酸分别涂抹板栗短雄花序,结果显示仅赤霉素能够抑制短雄花序顶端的细胞程序性死亡,并在一定程度上恢复短雄花序的伸长生长。通过RT-PCR扩增方法,从板栗短雄花序芽变和正常雄花序cDNA中克隆出赤霉素受体基因GID1部分序列。测序及序列分析结果表明:克隆的cDNA片段为786 bp,所推导的氨基酸序列与杨毛果GID1氨基酸序列有91%的同源性,与陆地棉、蓖麻GID1均有85%的氨基酸序列同源性。经氨基酸序列功能分析,推测该GID1序列是板栗有编码功能的赤霉素受体基因,命名为CmGID1(GenBank登录号为HQ651231)。实时荧光定量PCR结果显示,从花序萌发至花药萌发前期,除其中一个时期(5月23日)外,芽变短雄花序CmGID1的表达量均高于正常雄花序;在花序的快速生长期,芽变短雄花序CmGID1表达量显著高于正常雄花序(P<0.01);且赤霉素处理后恢复生长的短雄花序CmGID1表达量显著降低(P<0.01)。综合试验结果,初步揭示了该短雄花序为一个赤霉素缺陷型突变体。