云南不同蚕区僵蚕致病菌株的分离鉴定及致病力差异研究

[目的]了解云南省不同蚕区家蚕僵蚕病原的多样性及不同来源白僵菌菌株对家蚕的致病力差异。[方法]从云南省9个县(市)收集僵蚕样品,分离纯化获得病原菌,通过观察菌株的形态特征、产孢结构,并结合菌株核糖体rDNA-ITS序列的系统发育分析,确认病原种类。同时测定分析不同地理来源以及不同孢子浓度的球孢白僵菌菌株对家蚕致病力的影响。[结果]形态学和ITS序列分析发现,云南蚕区僵病病原菌属于白僵菌属(Beauveria)、虫草菌属(Cordyceps)和绿僵菌属(Metarhizium),其中以球孢白僵菌(Beauveria bassiana)和莱氏绿僵菌(Metarhizium rileyi)为主要病原,分别占57.58%和30.30%。不同地理来源的球孢白僵菌株对家蚕幼虫的致病力存在一定差异,供试菌株侵染后,家蚕的僵蚕率在72.5%~95.0%,半致死时间(LT50)在5.093~7.133 d,其中LL1-1菌株的僵蚕率最高(95.0%),半致死时间最短(5.093 d),致病力最强;CB1-2菌株的僵蚕率较低(75.0%),半致死时间最长(7.133 d),致病力最弱。随着接种浓度的增加,病原的致病力变强,家蚕的僵蚕率也升高。[结论]云南省蚕区家蚕僵病病原种类呈多样性,球孢白僵菌和莱氏绿僵菌为主要病原菌,不同来源的白僵菌株对家蚕的致病力存在差异,本研究结果可为家蚕僵病的防治和僵蚕的生产提供参考依据。

家蚕体内细菌感染模型建立及不同菌株的协同致病特征分析

【目的】建立家蚕体内细菌感染模型,揭示不同细菌协同感染家蚕的致病力,明确云南蚕区家蚕细菌病的发病原因及其规律,为指导家蚕生产过程中细菌病的防治提供科学依据。【方法】从家蚕龄期、感染浓度和感染方法3个因素出发构建家蚕体内细菌感染模型,然后选用从云南地区自然发病蚕体中分离获得的5株肠道致病菌[Mammaliicoccus sciuri(葡萄球菌属)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、Klebsiella variicola(克雷伯菌属)和Pseudomonas soli(假单胞菌属)],开展5种单菌感染及17种组合协同感染试验。【结果】通过建立家蚕体内细菌感染模型发现,家蚕群体添食细菌比单头添食的存活率低;细菌感染浓度选择时建议二龄期家蚕感染选用5.0 OD/mL、四龄期和五龄期家蚕感染选用10.0 OD/mL。选取的5株细菌对家蚕均具有致病力,整体上表现为随着细菌感染时间的延长,家蚕存活率逐渐降低;小蚕期感染细菌对家蚕的影响更明显,至五龄期有大量家蚕发病死亡,与养蚕过程中的细菌病发生规律相同。无论是小龄期感染还是大龄期感染,细菌协同感染的家蚕存活率总体上低于单菌感染,尤其是粘质沙雷氏菌参与的协同感染,至上蔟期的家蚕存活率均较低。此外,无论是二龄期感染还是四龄期感染,夏季家蚕的存活率总体上均高于春季家蚕,说明云南蚕区夏季家蚕的抗病力优于春季家蚕。【结论】5株分离自云南地区自然发病蚕体的病原菌对家蚕产生明显致病性,其致病性与感染龄期、感染浓度、不同细菌组合及感染季节等均有关,总体上具体表现为小蚕期感染较大蚕期感染对家蚕的影响更明显,细菌协同感染比单菌感染的危害更严重,且夏季家蚕感染后的存活率高于春季家蚕。

家蚕BmNPV压力选择品系的细菌病发生及其病原分离鉴定

【目的】调查鉴定核型多角体病毒(BmNPV)压力选择家蚕相关品系细菌病发病原因,为蚕作生产上家蚕抗Bm NPV品种细菌病防治提供理论依据。【方法】相同批次和饲养条件下,对BmNPV压力选择自建品系P50Nn(n表示代)和抗Bm NPV品种4个母种品系苏N、菊N、明N、虎N的正常保种组发生家蚕细菌病情况进行初步调查,分离培养病蚕肠道细菌,开展16S rDNA分子鉴定、革兰氏染色和扫描电镜等形态学鉴定,以及糖发酵、吲哚试验等20项生化鉴定。【结果】细菌病导致家蚕BmNPV压力选择品系添食BmNPV第3代次的P50N3结茧率为47.63%,抗BmNPV育种母种品系添食BmNPV多代次的菊N结茧率最低为34.72%,而未添食过BmNPV的对照品系P50结茧率为96.15%,P50N3和菊N结茧率与P50呈极显著差异(P<0.01)。病蚕肠道细菌经过多次分离纯化,显微镜观察球状细菌较多;分子鉴定后获得肠球菌属(Enterococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和肠杆菌属(Enterobacter)等7类细菌属,其中葡萄球菌属占比(30.00%)最高,其次为肠球菌属和沙雷氏菌属,均为16.67%。选择分子鉴定一致性最高的8株不同细菌,进一步进行形态学鉴定和生化鉴定,与分子鉴定结果一致。【结论】家蚕BmNPV压力选择品系的细菌病发生主要由葡萄球菌、肠球菌和多种肠杆菌科细菌引起,在BmNPV压力选择早期家蚕细菌病发生更严重。

马铃薯甲虫虫生真菌分离及强致病菌株筛选

采用常规组织分离法,从新疆石河子、伊宁和昌吉等地区采集的马铃薯甲虫发病成虫虫体上分离并纯化出36个真菌菌株。经形态学初步观察,这些菌株分属于白僵菌（Beauveria）、轮枝菌（Verticillium）、镰刀菌（Fusarium）、青霉（Penicillium）、木霉（Trichoderma）和曲霉（Aspergillus）等属。用这些菌株的悬浮液喷雾接种家蚕（Bombyx mori）幼虫后显示,有26个菌株（白僵菌19株,轮枝菌4株,镰刀菌2株,木霉1株）对家蚕幼虫表现出不同程度致病力,并在接种后5~9 d始见虫体死亡。白僵菌的19个菌株的致病力都非常强,接菌后11 d幼虫累计死亡率（LR11d）为75.80%~95.76%,致死中时（LT50）为7.5~10.2 d,其中白僵菌MJ01、MJ07、MJ09和MJ19的致病力最强,它们的LR11d和LT50分别达到91.24%~95.76%和7.5~8.0 d。轮枝菌的4个菌株的致病力亦较强,它们的LR11d和LT50分别为56.25%~61.55%和9.1~10.3 d。镰刀菌的2个菌株和木霉的1个菌株的致病力都比较弱,其LR11d和LT50分别为7.25%~11.00%和18.5~28.8 d。

二溴海因药液对家蚕真菌病和病毒病主要病原体的消毒效果试验

推广使用高效、安全的消毒药剂是规模化养蚕防病技术体系中的重要内容之一。将新型消毒药剂二溴海因配制成不同浓度药液,对家蚕真菌病、病毒病的主要病原体进行消毒试验。结果表明,以0.5g/L二溴海因药液进行蚕体消毒,可达到100%杀灭白僵菌、黄曲霉菌的消毒效果;单独使用二溴海因药液不能杀灭家蚕核型多角体病毒(BmNPV)、家蚕质型多角体病毒(BmCPV),但在质量浓度为0.5g/L的二溴海因药液中添加5.0g/L碳酸钠后,即可达到100%杀灭BmNPV、BmCPV的消毒效果,并且碳酸钠的添加不影响针对白僵菌、黄曲霉菌的蚕体消毒效果。二溴海因药液对家蚕的安全性试验表明,4～5龄期每天添食1次用1.0g/L(或0.5g/L)二溴海因+5.0g/L碳酸钠溶液浸润的桑叶,对家蚕的生长发育无明显影响,全茧量、茧层率等经济指标与对照相仿。综上初步认为,二溴海因和碳酸钠混合的消毒药液可以应用于家蚕真菌病、病毒病主要病原体的消毒。

生物防治白僵菌与家蚕病原白僵菌的生物学特性初步比较

对广州市森林保护用生防白僵菌Bb2、华南农业大学保存生防用白僵菌Bb7以及收集自广东省化州蚕种场、化州市笪桥村、翁源县硝村等蚕区的3株家蚕白僵菌分离株(Bb8、Bb13、Bb14),分别用PDA培养基进行分离和扫描电子显微镜观察,并对菌株的生物学特性进行初步比较,为开展家蚕白僵病的病原溯源和防控研究,以及为评估蚕区使用白僵菌农药对养蚕生产安全的影响提供实验依据。结果表明,上述5株白僵菌的菌落形态、营养生长量、产孢量等生物学性状存在差异,生长最快的是Bb2菌株,产孢量最高的是Bb8菌株和Bb13菌株;2株僵蚕蛹来源白僵菌Bb8、Bb14的分生孢子在扫描电子显微镜下呈球形或近球形,二者同为球孢白僵菌[Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.]。研究结果还显示部分蚕区的家蚕白僵菌与生物防治用白僵菌有一定程度的生物学特征相似性,而相同地区的家蚕病原白僵菌也存在差异,这暗示广东蚕区家蚕白僵病的病原来源复杂,对于2株生防用白僵菌菌株Bb2、Bb7是否为家蚕病原白僵菌还有待进一步研究。

亚迪欣对家蚕病原体的消毒效果研究

亚迪欣是一种高效广谱性消毒药剂 ,对家蚕病毒病、真菌病、细菌病、微粒子病的病原体有显著的消毒效果。与常用的蚕用消毒剂蚕用消毒净比较 ,亚迪欣水溶液有效成分较稳定 ,对金属的腐蚀性较小 ;添食对家蚕的生长发育、茧质、丝质及种质未见不良影响。实际使用浓度为 2 5 0倍溶液用于蚕室蚕具消毒 ;10 0 0倍溶液用于桑叶叶面消毒。对细菌芽孢和毒素、微孢子消毒可用 16 0

拮抗放线菌BS-112的鉴定及抗菌物质粗提物对家蚕主要病原菌的抑制作用

以绿僵菌(Nomuraea rileyi)和黑胸败血病菌(Bacillus sp.)为靶标,从泰山林地土壤中分离获得一株对多种家蚕病原菌具有强烈拮抗作用的放线菌BS-112。根据该菌株的形态特征、培养特征、理化性质、细胞壁组分及16S rDNA序列分析结果,将其鉴定为吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)。该菌株抗菌谱广,抗菌物质耐高温,在酸、碱环境比较稳定,抗菌物质粗提物对黑胸败血病菌和绿僵菌的最小抑菌浓度分别为19.53μg/mL和78.13μg/mL,最小杀菌浓度分别为78.13μg/mL和156.25μg/mL,表明在较低浓度下即可达到杀菌效果。

臭氧消毒对家蚕病原体的灭活作用研究初报

为了明确臭氧对家蚕病原微生物的消毒效果 ,用新产生的臭氧气流对家蚕几种病原微生物进行了杀灭效果试验 ,结果表明 ,新生臭氧气流处理 30min ,可使家蚕大多数病原体完全失活或使其致病力下降 ,且对蚕体的生长发育及生理机能无不良影响。

熏烟消毒剂鲁烟Ⅰ号对家蚕病原体的消毒效果试验

二溴海因(DBDMH)是目前国际上公认的杀菌力最强的新一代氧化型绿色环保广谱消毒药剂。采用二溴海因并添加助燃剂配制成蚕用熏烟消毒剂鲁烟Ⅰ号用于家蚕病原体的消毒,结果显示鲁烟Ⅰ号对感染家蚕的主要病毒、细菌、真菌病原均有很好的灭活效果:对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和质型多角体病毒(BmCPV)用2g/m3鲁烟Ⅰ号熏烟30min以上,对苏云金芽孢杆菌用2g/m3或1g/m3鲁烟Ⅰ号分别熏烟1、2h,对白僵菌和曲霉菌的分生孢子用1g/m3鲁烟Ⅰ号熏烟30min,均可达到100%杀灭病原菌的消毒效果。建议在养蚕前后采用3g/m3鲁烟Ⅰ号对蚕室蚕具熏烟消毒,以达到杀灭家蚕主要病原菌的目的。

蚕用熏烟消毒剂蚕熏安的研究初报

利用高氯制剂为主要成分研制出了一种新型蚕用熏烟消毒剂蚕熏安。为了明确其消毒效果及用于蚕业生产的安全可靠性,试验分别采用了培养基接种和蚕体接种等方法对家蚕多种病原体进行了熏烟消毒试验,并根据养蚕生产特点进行了毒性试验及安全性测试。结果表明:一定剂量的蚕熏安点燃后密闭一定时间可使家蚕生产中常见的大多数病原体完全失活,且对家蚕无明显毒副作用。

化学消毒和堆肥一体化处理对蚕沙中病原物的消毒效果

采用化学消毒和堆肥处理一体化方案的双重杀菌措施,更有效地杀灭蚕沙中的病原物。用几种常用化学药剂对收茧后的蚕沙就地消毒处理,以3 g/L三氯异氰脲酸+5%石灰混合液对蚕沙堆表层及深1 cm处的家蚕微孢子虫(Nb)和家蚕质型多角体病毒(Bm CPV)的灭活作用最明显,可使蚕沙中的部分病原物在转移出蚕室之前被杀灭。将化学消毒后的蚕沙进行堆肥处理,第2天堆温即可升至60℃以上,堆肥过程中堆体上、中、下各部位50℃以上的高温时间分别达到35、35、25 d,可以致Nb和Bm CPV 2种家蚕病原物完全灭活。观察蚕沙经堆肥高温处理后,2种病原物的结构变化符合高温导致病原结构蛋白凝固变性的特征。试验结果表明:采用预先在蚕室对蚕沙进行化学消毒后再进行堆肥处理的消毒和堆肥一体化方案,能够更有效地阻断家蚕的病原物在养蚕环境中扩散。

生姜黄酮粗提液对部分家蚕病原细菌的抑杀效果试验

采用天然植物活性成分防治家蚕细菌病不仅具有安全、环保的特点,而且还能解决病原菌的耐药性问题。生姜中富含的黄酮类物质具有多种生物活性及药理作用。采用滤纸片法和打孔法研究了生姜黄酮粗提液对家蚕病原细菌卒倒杆菌(Bacillus thuringiensis)和青头败血病菌(Aeromonas)的体外抑菌效果,结果表明7.46、3.73、2.49、1.49和1.07 mg/mL生姜黄酮粗提液对2种家蚕病原细菌均有一定程度的抑菌效果,且对革兰阴性或阳性菌的抑菌效果没有明显差异。给感染卒倒杆菌的家蚕添食1.49 mg/mL和1.07 mg/mL生姜黄酮粗提液均具有一定的治疗作用,且效果略好于0.1 mg/mL蚕用盐酸诺氟沙星。此外,生姜黄酮粗提液用于蚕病防治对家蚕的生长发育无不良影响。

蚕病及其防治研究进展

从蚕病病原、蚕病的流行规律、蚕的抗病生理、病原检测技术、非传染性蚕病、蚕病防治等方面对最近的研究进展进行了综述。

球孢白僵菌松毛虫分离株对家蚕的致病力

长期以来对于释放球孢白僵菌防治松毛虫是否会导致或加重家蚕白僵病一直存在较大争议，并同时影响真菌杀虫剂的应用。为科学评价球孢白僵菌松毛虫分离株对家蚕的致病风险，并保证研究结果的代表性和准确性，本研究共使用南方8省（区）的64株松毛虫分离株和4省（区）的12株家蚕分离株对3龄家蚕进行了3次致病性试验。结果表明，除其中1株松毛虫分离株外，不管是松毛虫分离株还是家蚕分离株，对家蚕都有一定致病性，但差异较大。在3×107孢子/mL 的浓度下，30株松毛虫分离株的平均侵染率10.2%极显著低于8株家蚕分离株的89.6%；在1.5×108孢子/mL的浓度下，34株松毛虫分离株对家蚕的平均侵染率36.4%极显著低于6株家蚕分离株的90.6%；松毛虫分离株在1.5×108孢子/mL浓度下的侵染率极显著高于3×107孢子/mL下的侵染率，而家蚕分离株在两种浓度下无显著性差异。在1.5×108孢子/mL的浓度下4株对家蚕致病力较强的松毛虫分离株的LT50为7.45～8.20 d，平均7.83 d，比6株家蚕分离株LT50（3.43～3.72 d）的平均数3.62 d多4.21 d。根据毒力较强的家蚕分离株B1和B5与毒力最弱和最强的松毛虫分离株D26和D22的致死浓度的比较，家蚕分离株对家蚕的毒力是松毛虫分离株的132～15733倍；根据他们的致死剂量的比较，家蚕分离株的毒力是松毛虫分离株的43～2201倍。这一对比数据充分表明，尽管不同的松毛虫分离株对家蚕的毒力不同，但所有的松毛虫分离株都具有明显的寄主专化性。综合分析表明，我国南方使用白僵菌杀虫剂防治松毛虫在家蚕中诱发流行病的风险很小。

吸水链霉菌BS-112菌株产生抗家蚕病原真菌活性物质的发酵培养基配方优化

为了开发利用吸水链霉菌BS-112菌株产生的抗真菌活性物质防治家蚕真菌病,在单因素试验基础上通过正交试验优化BS-112菌株分泌产生抗真菌活性物质的发酵培养基配方。优化后的最佳发酵培养基配方为:18.0g/L葡萄糖,12.0g/L玉米粉,35.0g/L黄豆饼粉,0.4g/LKH2PO4,0.8g/LMgSO4。优化发酵培养基配方后的菌株发酵液对家蚕病原绿僵菌的抗菌效价达到4916.85μg/mL,较基础培养基提高了3.08倍。分别以价格低廉的玉米粉和豆饼粉作为发酵培养基的缓效碳源和有机氮源,有利于该菌株在蚕用抗生素产业化开发的应用。

中草药对家蚕病原细菌的体外抑菌试验

本文选用11味中草药对蚕业生产上常见的细菌病病原（黑胸败血菌、苏云金杆菌和灵菌）进行了体外抑菌试验。结果表明：黄岑、黄连、黄柏、大黄、秦皮、连翘对3种病原菌均有不同程度的抑制作用,金银花、蒲公英、苍耳子、黄芪则对3种病原菌无抑制作用。采用平皿内试物液稀释法测定4种单味中草药及其两两组合后的复方中草药对3种病原菌的体外M IC,结果单味中草药对3种病原菌的M IC在31.25-125 mg/mL之间;9种两味药物组合的M IC在7.8125-62.5 mg/mL之间,表现出协同作用和相加作用,显示出中药配伍的优势。

家蚕病原性微孢子虫SCM_8的研究

家蚕病原性微孢子虫SCM8的生活史单型 ,所有时期核不成对 ,发育周期为 9～ 10d。蚕体内发育的裂殖体生殖呈带状分裂 ,以多分裂的方式进行增殖 ,裂殖体近椭圆形 ,外被寄主细胞的内质网膜 ;母孢子以出芽方式进行原生质团的分割 ,形成多个单核孢子母细胞 ,孢子成熟不同步 ,孢囊内有几个至数十个孢子不等 ;SCM8孢子单核 ,卵圆形 ,大小介于SCM7(Endoreticulatusbombycis)和家蚕微孢子 (Nosemabombycis)之间 ,并随继代数的增加而趋小 ,到第 3代时大小稳定 ,与SCM7相近 ;成熟孢子的极膜层前部结构致密 ,后部结构相对疏松 ;孢子的极丝单列 ,9～ 10圈 ,极丝倾角为 4 2° ;后极泡圆形 ,较大。SCM8仅感染寄生家蚕的中肠上皮组织 ,具食下传染、无胚种传染能力 ,致病力较弱 ,感染中量 (IC50 )为 1 2 9× 10 5,病程 12d以上。SCM8的分类地位为微孢子虫门 ,单倍期纲 ,格留目 ,科、属暂未确定。

柞蚕寄蝇病研究概述

概述了柞蚕寄蝇病病原的种类、柞蚕饰腹寄蝇的生物学特性和组织胚胎学、寄蝇病的防治及药剂作用机制等方面的研究成果,提出了当前生产中柞蚕寄蝇病防治上存在的问题并展望了研究方向。

天蚕白僵病的菌种鉴定及致病性的研究

天蚕患白僵病后使蚕体色稍暗、食欲减退、行动呆滞、蚕体上出现油渍状病斑,死前排软粪,尸体硬化,最后被白僵菌的白色菌丛所覆盖。引起天蚕白僵病的病原菌是[Beauveria bassiana(Bals.)Vuill.],分生孢子呈球形或卵圆形,球形直径2.5～4.4μm,卵圆形为2.8～4.4×2.5～3.8μm,多数分生孢子堆积在一起呈白粉状。体内的营养菌丝呈丝状无色,具隔膜,分枝生长,直径为2,5～3.3μm。芽生孢子圆筒形,大小为6.3～46.6×1.0～3.9μm。体表的气生菌丝直径为2.5～3.3μm,无色具隔膜,分枝生长。试验证明白僵菌能经接触侵染天蚕、桑蚕和柞蚕虫体引起白僵病,来自3种蛋体上的白僵菌可以互相感染,感染率均为100％。