HBeAg gene expression with baculovirus vector in silk worm cells

ＩＮＴＲＯＤＵＣＴＩＯＮＭｉｙａｎｏｈａｒａｅｔａｌ［１］ｆｉｒｓｔｏｂｔａｉｎｅｄｐｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈｔｈｅｅｘｐｒｅｓｉｏｎｏｆＨＢｅＡｇａｃｔｉｖｉｔｙｂｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇａｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ；ｌａｔｅｒｒｅｓ...

家蚕Tret1-X1基因对家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的基因表达和基因组复制的影响

家蚕促海藻糖转运蛋白1异构体X1(Bombyx mori facilitated trehalose transporter Tret1-like isoform X1,BmTret1-X1)主要参与家蚕糖代谢过程。为探究其在家蚕抗BmNPV感染过程中的作用,克隆BmNPV抗性家蚕品系AN与易感品系C108的BmTret1-X1基因,发现基因编码区存在4个SNP导致的氨基酸改变,两者的预测蛋白质结构存在差异。利用pIZT/V5-His-mCherry表达载体在BmN细胞中过表达BmTret1-X1,BmNPV感染后24 h、48 h的BmNPV增殖受到抑制,BmNPV基因lef-3、vp39、p10和gp64的转录水平低于对照组(P<0.05),其中感染后24 h vp39基因的表达量与对照组相比差异达1 089倍,细胞中病毒基因组DNA复制也受到明显抑制。转染BmTret1-X1基因siRNA使BmN细胞中该基因表达量降低约一半,BmNPV的lef-3、vp39、p10和gp64转录水平升高,但BmNPV增殖和基因组DNA复制水平未见明显变化。综上所述,BmN细胞中BmTret1-X1基因的高表达对BmNPV的基因表达、DNA复制及病毒增殖具有抑制作用,该基因在家蚕对BmNPV的抗性形成过程中具有一定作用。

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒新型载体ｐＢｍ９２，该载体将多角体蛋白基因的起始密码ＡＴＧ改变为ＡＴＴ，然后在多角体蛋白基因的＋１２位后连接有５个外源基因的克隆位点。将ＨｕＩＦＮ－β基因克隆在多角体蛋白基因的＋１２位后，构建了ｐＢｍＩＦＮ＋１２；同时构建了Ｈｕ ＩＦＮ－β克隆在－３位后的转移载体ｐＢ－ｍＩＦＮ－３。

乙肝病毒S基因在家蚕细胞及蚕体内高效表达

把人乙型肝炎病毒（ａｄｒ）的表面抗原Ｓ基因插入到家蚕核型多角体病毒基因组中，构建了重组病毒ＢｍＮＰＶＳ。用重组病毒感染家蚕细胞，测得每毫升培养物（１×１０＾５细胞）ＨＢｓＡｇ表达量达３５．５ｕｇ；感 家蚕幼虫和蛹，经检测表明ＨＢｓＡｇ产量平均为每头蚕约７５０ｕｇ，每只蛹约为６９０ｕｇ。初步纯化的表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ和电镜观察证实，表达产物是直径为２２ｎｍ的颗粒。

用杆状病毒载体在家蚕细胞中表达HBeAg基因

以ＰＣＲ技术扩增含有ＰｒｅＣ信号肽序列及完整的ＨＢｅＡｇ基因的序列（即ＨＢｃＡｇ基因５′端４４７ｂｐ），在５′端加上合适的酶切位点，克隆到家蚕核多角体病毒转移载体ｐＢｍ０３０上，与野生型ＢｍＮＰＶＤＮＡ共转染家蚕ＢｍＮ细胞，空斑纯化后得到多角体基因失活的重组病毒。ＥＬＩＳＡ法测定表明培养液上清中ＨＢｅＡｇ效价达１∶３２０００，细胞内ＨＢｅＡｇ效价为１∶２０００，培养液及细胞内的ＨＢｃＡｇ含量极低（＜１∶１６０）。研究结果表明，ＢｍＮ细胞能正确识别与切割ＨＢｅＡｇ信号肽序列，所表达的ＨＢｅＡｇ效价高，纯度好。

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.

重组家蚕病毒表达系统转移载体的构建和β─半乳糖苷酶的表达

本文从中国农科院蚕业研究所提供的我国家蚕核多角体病毒镇江株中获得了多角体蛋白的强启动子，用此启动子构建了家蚕病毒表达系统的转移载体。外源基因能在此启动子控制下在家蚕细胞和虫体中进行高效表达。用此载体我们首先成功地在家蚕虫体中高效表达了β－半乳糖苷酶，表达量达到５８０μｇ／条蚕，从而证实我们构建的载体是可靠的、有效的，可用于家蚕重组病毒表达外源基因的研究。

人α_1－干扰素基因真核表达载体的构建及其活性

选用与ＨｕＩＦＮ－α１基因及其信号肽相应的引物，采用ＰＣＲ技术，从中国人血白细胞染色体中分离带有信号肽ＩＦＮ－α１基因片段，分别克隆到质粒Ｍ１３ｍｐ１９和Ｍ１３ｍｐ１８中，通过序列分析进行鉴定，然后克隆到家蚕多角体病毒（１３０ｍｂｙｘｍｏｒｉＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓＶｉｒｕｓ，ＢｍＮＰＶ）载体ＰＢＦ５的ＥｃｏＲＩ和ＸｂａＩ之间，用合成的相应寡核苷酸片段为引物进行双链测序，鉴定为阳性重组转移载体后，将其ＤＮＡ和ＢｍＮＰＶ基因组ＤＮＡ共转染家蚕细胞，筛选出重组病毒，再将其感染家蚕细胞，测得细胞培养上清中ＩＦＮ活性为１．０×１０６ＩＵ／ｍｌ。

家蚕生物反应器表达传染性法氏囊病病毒多聚蛋白的免疫原性研究

将传染性法氏囊病病毒(IBDV)浙江分离株JD1的多聚蛋白(VP2/4/3)基因克隆到家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中,重组载体与杆状病毒Bm-BacPAK6的线性化基因组DNA共转染家蚕细胞后,将获得的重组病毒BacPAK-A感染家蚕5龄起幼虫进行虫体内表达.用感染后第5日的蚕血淋巴作抗原制备油佐剂苗免疫14日龄非免疫鸡,安全性试验表明,接种1倍和5倍免疫剂量的试验鸡在临床反应和剖检中均无异常变化;在免疫-攻毒试验中设杆状病毒表达的IBDVVP2蛋白和正常蚕血淋巴免疫对照组,并于28日龄加强免疫,25d后用IBDV强毒BC6/85攻击.通过临床保护率、病理保护率及血清学试验表明,基于多聚蛋白制备的疫苗更成功地诱导了体液免疫应答,比VP2蛋白对IBDV强毒的攻击具有更高的保护力,更适于作为IBD基因工程亚单位疫苗的抗原成分.

融合6个组氨酸的人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子在家蚕幼虫中的表达

将融合6个组氨酸(6×his)序列的hGM-CSF基因插入杆状病毒转移载体pBacPAK8中得到杆状病毒重组转移载体pBacPAKHis-GM-CSF,pBacPAKHis-GM-CSF DNA与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染BmN细胞,获得了表达rhGM-CSF融合蛋白的重组病毒vBacPAKHis-GM-CSF.用重组病毒感染家蚕五龄起蚕,分别在24、48、72、961、20 h和144 h剪腹足取蚕血淋巴,ELISA法测得rhGM-CSF融合蛋白在120 h的蚕血淋巴中表达量最高,约为15μg/mL蚕血淋巴.融合蛋白通过Poly-His Protein Purification Kit纯化.SDS-PAGE和Western blotting分析表明,表达产物是3种糖基化程度不同的,分子量分别约为18、203、1 kD的蛋白质.

以核多角体病毒为载体在家蚕中生产外源蛋白

以家蚕核多角体病毒（ＢｍＮＰＶ）为载体，在家蚕幼虫或家蚕培养细胞系中表达的外源基因越来越多，其表达的产物已涉及到医用药物、医疗诊断、疫苗生产、生物防治等诸多领域，文章就ＢｍＮＰＶ的特性及其基因组构造，多角体蛋白基因的特性，重组ＢｍＮＰＶ的构建及其在家蚕幼虫体内和细胞系中的表达，ＢｍＮＰＶ－家蚕表达系统的外源蛋白生产效率及其应用等各个方面作了全面、系统的综述。

影响家蚕表达外源基因效率的几个重要因子的比较研究

本研究以重组病毒rSj14NPV为感染病毒,通过比较纯化蛋白的产量,对家蚕作为生物反应器生产基因工 程产品的适宜蚕品种与相关的重组病毒接种技术进行了比较研究。研究结果表明:871×872、秋风×白玉为表达 Sj14的适宜蚕品种;重组病毒接种量与蛋白表达量有关,适宜接种量为4～5μL/蚕;适宜接种时间以5龄2日龄为 优;以家蚕表达外源基因,最好将重组病毒以家蚕细胞复苏后再接种家蚕以保证获得较高的表达效果。

戊型肝炎病毒结构蛋白p166在家蚕细胞及蛹体中的表达

目的探讨戊型肝炎病毒结构蛋白基因片段p166(HEVp166)在家蚕/BmNPV表达载体系统中的表达水平。方法应用PCR、基因克隆及共转染等技术将p166插入到家蚕杆状病毒多角体启动子的下游,构建重组病毒;并在家蚕细胞及家蚕蛹中表达p166。用间接免疫荧光试验检测感染36h后家蚕培养细胞中p166蛋白的表达情况。收集感染后144h的蛹样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodiumdodecylsulphate-Polyacrylamidegelelectrophoreses,SDS-PAGE)及Westernblot-ting分析。结果获得含有HEVp166基因片段的重组杆状病毒表达载体Bm-HEV166。Bm-HEV166能在家蚕细胞中表达p166蛋白,感染后的培养细胞中出现绿色球状体;感染Bm-HEV166的家蚕蛹血淋巴能高效表达p166蛋白,蛹血淋巴能与抗p166单克隆抗体发生特异性反应,在Mr为19000大小的位置出现一条明显的杂交条带。结论HEVp166基因片段在家蚕蛹中能获得高效表达,为进一步研制HEV口服疫苗奠定基础。

昆虫杆状病毒在生物技术研究中的应用

随着昆虫杆状病毒分子生物学研究的不断深入 ,昆虫杆状病毒在生物技术研究中也得到了应用。利用杆状病毒作为载体 ,在昆虫细胞和虫体内表达外源基因 ,形成了昆虫杆状病毒载体表达系统 ,利用杆状病毒携带外源基因 ,通过同源重组将外源基因导入到家蚕的基因组构建了转基因家蚕 ;通过向杆状病毒基因组中插入毒素、激素、酶抑制剂等的基因或从杆状病毒基因组中删除某个基因 ,或通过不同杆状病毒间的杂交 ,使子代病毒的宿主域扩大 ,从而提高了杆状病毒作为生物杀虫剂的杀虫效果。

RNA干扰技术和家蚕杆状病毒表达系统在纤维素酶研究中的应用前景

植物通过光合作用产生的纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素酶是糖苷水解酶的一种,能有效地将农作物秸杆等富含纤维素的物质水解为葡萄糖,进而发酵产生生物乙醇,从而解决农业、再生能源以及环境污染等问题。随着生物化学、分子生物学以及基因工程等多种交叉学科的快速发展,获得适合工业化的高活力的纤维素酶指日可待。RNA干扰是利用双链RNA特异性地降解相应序列的mRNA,从而特异性地阻断相应基因的表达,是后基因组时代的一种强有力的调控目的基因表达的实验工具。家蚕杆状病毒表达系统是一种快速、高效表达外源基因的技术手段,目前该系统的发展和应用已经非常成熟。本文综述了纤维素酶的特性以及近年来国内外对纤维素酶、RNA干扰和家蚕杆状病毒表达系统的研究进展,并对该两种实验技术手段在今后纤维素酶研究中的应用前景作了预测和展望。

家蚕蛹表达的乙型肝炎表面抗原中蛋白口服免疫原性的研究

目的 探讨家蚕蛹表达的重组乙型肝炎表面抗原中蛋白 [rHBsAg(PreS2 +S) ]口服免疫原性。方法 选择 4周龄的SD大鼠 ,将重组病毒感染后的家蚕蛹 ,制成口服剂型灌胃大鼠 ,ELISA方法检测抗 HBs抗体及抗 PreS2抗体。结果 在灌胃重组蛋白组中有 4 0 %鼠体血清内检测到了特异性抗 HBs抗体及抗 PreS2抗体 ,抗体应答反应持续 2～ 3周 ;口服免疫后抗体转阳的SD鼠加强免疫后能产生较强的二次免疫应答。进一步研究表明 ,口服家蚕蛹表达的rHBsAg(PreS2 +S)具有加强免疫的效果。对酵母重组疫苗单剂腹腔注射过的SD鼠 ,用家蚕蛹表达的rHBsAg(PreS2 +S)灌胃加强免疫后 ,能诱导鼠体迅速产生较强的抗 HBs抗体。结论 家蚕

用杆状病毒载体在家蚕细胞中表达HBeAg基因及其表达产物纯化的研究

以 PCR技术扩增含有 Pre- C信号肽序列及完整的 HBe Ag基因序列 (即 HBc Ag基因5′端 447bp) ,克隆至家蚕核多角体病毒转移载体 p Bm0 30 ,与野生型 Bm NPV DNA共转染家蚕Bm N细胞 ,空斑纯化后得重组病毒。研究结果表明 Bm N细胞能正确识别与切割 HBe Ag信号肽序列 ,所表达的 HBe Ag效价高 ,纯度好 ,ELISA法测得培养上清中 HBe Ag效价达 1∶ 32 0 0 0。上清经过 Sephacry1 S- 2 0 0和 DEAE- Sepharose FF两步纯化 ,得到电泳纯 HBe Ag。

鸡α干扰素在家蚕中的表达及抗病毒活性测定

鸡α干扰素在防御病毒感染及治疗病毒性疾病中起着重要的作用。旨在利用家蚕杆状病毒表达系统研制有活性的鸡α干扰素。首先对鸡α干扰素基因(ChIFN-α)进行了优化与合成,将其克隆到杆状病毒转移载体pVL1393中,与ORF1629缺损的亲本病毒BmBcmid共转染,纯化重组病毒,再感染家蚕幼虫,收集蚕血淋巴以检测α干扰素基因的表达。Western blot分析结果显示,成功表达出分子量约为19 kD的鸡α干扰素。采用细胞病变抑制法在Vero-VSV*GFP系统中测定表达产物的抗病毒活性。所的表达的鸡α干扰素具有明显的抗病毒活性,活性不低于3.2×105 U/mL。利用杆状病毒载体系统成功地表达了具有抗病毒活性的鸡α干扰素的成熟蛋白,为开发廉价高效的鸡干扰素生物制剂奠定了物质基础。

非转座子载体介导的转基因家蚕表达hIL-28A

为了探讨非转座子载体介导转基因家蚕表达外源基因的可能性,将hIL-28A克隆进昆虫细胞表达载体pIZT/V5-His,构建了重组载体pIZT/V5-His-hIL-28A.利用精子介导法将该重组载体导入家蚕卵,通过绿色荧光筛选并结合PCR、DNA杂交等分子鉴定,证实成功获得了转基因家蚕.Western blotting结果显示,转基因家蚕表达重组hIL-28A的分子质量为25 ku,ELISA检测结果显示,hIL-28A在G3代转基因蚕、后部丝腺、脂肪组织冻干粉中的含量分别为0.198、0.320和0.238 ng/g.表明通过非转座子载体介导可以将外源基因导入家蚕基因组并实现外源基因的表达.