应用巢式PCR法检测猪单个胚胎中的基因突变

单胚胎基因突变检测技术是以单个胚胎的裂解产物为模板进行DNA或RNA分析的方法,该技术的建立将为在单细胞水平进行基因表达和突变检测提供简便而快捷的方法。本研究设计了2对巢式引物,以显微注射了Cas9mRNA和猪SS基因2个靶点的gRNA的四细胞期孤雌胚胎为试验材料,通过蛋白酶K对猪单个胚胎进行裂解后直接进行巢式PCR分型,并检测到猪胚胎中SS基因的删除突变。该方法可以最大限度减少假阴性和假阳性结果的出现,在猪基因突变检测中具有重要作用。

单细胞巢式PCR检测RHD的初步研究

目的建立单细胞巢式PCR检测技术,用以检测单个细胞的RHD。方法采用稀释法获得单个细胞,直接提取DNA,根据RHD特点设计两对特异性引物进行巢式PCR,凝胶电泳观察结果,将扩增产物测序以检测扩增的目的基因。结果通过巢式PCR,阳性对照可以获得明显的目的产物,阴性和空白对照无扩增产物,10份Rh阳性单细胞检测标本均能检出RHD。结论建立的检测RHD单细胞巢式PCR检测技术具有很好的特异性和敏感性,可应用于生殖医学等领域,为预防Rh新生儿溶血病提供新的技术途径。

模板制备方法对单细胞PCR检测DMD基因的影响

旨在探讨模板制备方法对单细胞 PCR准确性的影响 ,采用 KOH/ DTT和液氮冻融煮沸两种不同方法裂解单个淋巴细胞 ,行 DMD基因外显子 17、19、4 4、4 5、4 8五重巢式 PCR.用 KOH/DTT法裂解的细胞扩增成功率为 98% ( 147/ 150 ) ,失败率为 2 % ( 3/ 150 ) ;用液氮冻融煮沸法裂解的细胞扩增成功率为 78% ( 117/ 150 ) ,失败率为 2 2 % ( 33/ 150 ) ,差异有显著性 (χ2 =2 8.4 ,P <0 .0 1) .结果表明单细胞 PCR模板制备与 PCR扩增失败有密切关系 ,选用合适的细胞裂解方法可提高单细胞

单细胞五重巢式PCR检测DMD基因

目的:探索建立单细胞多重巢式PCR检测杜氏肌营养不良症(DMD)基因外显子17、19、44、45、48的技术,及应用于植入前遗传学诊断(PGD)的前景。方法;获取正常男性单个淋巴细胞和无DMD家族史的单个胚胎细胞,行DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR,分析扩增成功率、假阳性率和假阴性率。结果:20个单个淋巴细胞5个外显子扩增成功率为97％(97/100)、假阳性率为4％(1/25)、假阴性率为0％(0/25),20个单个胚胎细胞5个外显子扩增成功率为80％(80/100)、假阳性率为0％(0/25)。结论:本文建立的单细胞DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR技术具有较高扩增成功率和特异性,应用于DMD的PGD具有现实的可能性。

巢氏PCR扩增强直性肌营养不良基因在植入前诊断中的局限性

目的 Ⅰ型强直性肌营养不良（myotonic dystrophy 1，DM1）是由于肌强直蛋白激酶基因（DMPK）3′端非翻译区的（CTG）。异常扩增导致。探讨用巢氏PCR法直接扩增该基因在植入前诊断的可行性。方法0．5％低熔点琼脂糖分离来自DMPK（CTG）100的DM1患者的单个精子，巢氏PCR法扩增DMPK基因。结果106例精子标本中53例扩增产物电泳为单条带，但48例产物显示为多条带，扩增产物长度介于（CTG）10至（CTG）30之间。结论利用低熔点琼脂糖可有效分离单个精子进行检查，而巢氏PCR在单细胞水平上直接扩增较多（CTG）n的DMPK基因时存在困难，应用于植入前诊断时容易造成误诊。

流式细胞分选技术及其在单克隆抗体制备中的应用

单克隆抗体是一类在疾病防治、药物开发、生命科学研究领域具有重要作用的生物活性蛋白质,目前已有多种制备途径。随着PCR技术的发展,单个细胞生产抗体技术迅速兴起;与其他制备技术相比,流式细胞分选技术依靠强大的光学分析与分选系统能够精准高效地将免疫细胞分群,后续通过基因工程的方法获得单克隆抗体。利用该技术生产的单克隆抗体具有可变区天然构象与抗原结合特异性强等显著优势,在病毒感染机制研究、抗肿瘤治疗、抗自身免疫病等方面具有重要价值。论文对单克隆抗体开发过程中各技术优劣对比与流式细胞分选在单克隆抗体开发中的过程、应用与发展趋势进行综述,以期为单克隆抗体制备技术的研究进展提供参考。

印迹基因Snrpn在人类卵母细胞及植入前胚胎mRNA表达

目的了解印迹基因Snrpn在人类卵母细胞和植入前胚胎的表达,以分析Snrpn基因表达对人类卵母细胞和早期胚胎发育的影响。方法采用单细胞巢式逆转录多聚酶链式反应(Single Cell Nested RT-PCR)方法,检测人类卵子和植入前各个阶段胚胎的印迹基因Snrpn mRNA表达情况。结果Snrpn在人类卵母细胞GV、MI、MII和植入前胚胎2、4、6、8细胞期都有表达,单卵母细胞扩增成功率为87.5%,单个胚胎为75.8%,平均扩增成功率为79.1%。单个卵母细胞和单个卵裂球扩增成功率无显著性差异(P>0.05),但单卵母细胞较单个卵裂球高。结论建立了比较稳定、可靠的单细胞巢式RT-PCR技术检测基因表达。印迹基因Snrpn在人类卵细胞和植入前胚胎的表达对卵子生长和胚胎发育有着重要意义。

反转录巢式多重聚合酶链式反应体系检测单细胞中时钟基因表达

目的建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nestedreverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系。方法选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对。以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度。体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度。使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因。应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较。结果巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA。反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板。利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义。结论建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异。

五重巢式PCR同步检测单细胞杜氏肌营养不良基因和性别的研究

目的 建立五重巢式PCR技术同步检测单细胞DMD基因和性别 ,探讨该技术在杜氏肌营养不良症的植入前诊断 (DMD -PGD)的可行性。方法 获取正常男性、女性单个淋巴细胞和无DMD家族史的单个胚胎细胞 ,用五重巢式PCR技术检测DMD基因外显子 17、19、44、48和SRY基因。结果 在正常男性单个淋巴细胞扩增成功率为 96 7% (145 /15 0 ) ,假阳性率为 4% (1/2 5 ) ,假阴性率为 0 (0 /2 5 )。在正常女性单个淋巴细胞扩增成功率为 98% (147/15 0 ) ,假阳性率为 0 (0 /2 5 ) ,假阴性率为 0 (0 /2 5 )。 15个胚胎细胞扩增成功率为 10 0 % (6 6 /75 ) ,假阳性率为 0 (0 /2 5 )。结论 本文建立的单细胞DMD基因外显子 17、19、44、48和SRY基因五重巢式PCR技术具有较高的敏感性和特异性 ,有望应用于DMD

基于单个B细胞抗O型口蹄疫病毒单克隆抗体的研制

为了建立基于单个B细胞制备抗体技术,本研究以O型灭活FMDV为抗原,采集健康C57/BL小鼠脾细胞,经过磁珠富集、流式B220+/CD38+/Ig G1+/抗原+分选,获得单个抗原特异性的B细胞。经单细胞巢式PCR反应扩增获得抗体完整轻、重链可变区序列后,分别构建轻/重链表达质粒,然后共转染HEK-293细胞后,成功获得3株特异性单克隆抗体,且证明均属于Ig G1型抗体;ELISA结果显示,获得的3株抗体均能与O型FMDV抗原结合;免疫荧光试验证明,3株抗体能够特异性结合细胞内复制的O型FMDV。本研究成功建立了基于单个B细胞直接制备抗FMDV单抗的方法,为后期开发特异性单克隆抗体打下了坚实的基础。