单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白基因腺病毒载体构建及其在体内外表达效力检测

目的:构建携带小鼠源性单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白(mSIGIRR)基因重组腺病毒并对其体内外表达效力进行检测。方法:构建重组穿梭质粒pDC316-mSIGIRR,行酶切、测序鉴定。将穿梭质粒和骨架质粒共转293细胞,包装重组腺病毒Ad.mSIGIRR,行PCR及滴度鉴定。Ad.mSIGIRR感染A549细胞及小鼠肺组织后,通过RT-PCR、Western blot、免疫组化检测mSIGIRR表达情况。结果:扩增得到目的基因片段与Genbank中序列一致,获得表达mSIGIRR蛋白的重组腺病毒。病毒感染滴度为4×109pfu/mL,在体内外感染模型中均有较高表达效力。结论:成功构建携带mSIGIRR基因重组腺病毒,为进一步研究SIGIRR在炎症调控中的作用及分子机制奠定基础。

硫化氢对大鼠内毒性急性肺损伤炎性反应及单免疫球蛋白白介素-1相关蛋白表达的影响

目的探讨吸入硫化氢(hydrogen sulfide,H_2S)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导人肺泡上皮A549细胞炎性反应及单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白(single immunoglobin IL-1 receptor related protein,SIGIRR)表达的影响。方法雄性SD大鼠40只分4组,每组10只。正常小鼠组;H_2S吸入组:仅吸入H_2S 80mg/m36h;ALI模型组:腹腔注射15mg/kg LPS;ALI+H_2S吸入组:腹腔注射15mg/kg LPS 1h后即吸入H_2S 80mg/m^3 6h,实验结束处死大鼠,观察肺组织病理学改变;ELISA法测肺组织匀浆及血浆中TNF-α及IL-1β水平;Western blot法检测肺组织SIGIRR蛋白表达水平。结果与正常大鼠及吸入H_2S组比较,ALI模型组大鼠出现典型急性肺损伤病理改变,肺损伤评分升高(P<0.05),肺组织匀浆及血浆中TNF-α及IL-1β水平增加(P<0.05);而给予吸入H_2S后,可减轻大鼠肺损伤程度(P<0.05),肺组织匀浆及血浆中TNF-α及IL-1β水平下降(P<0.05),且与ALI模型组相比,给予吸入H_2S后可上调肺损伤大鼠肺组织内SIGIRR的表达。结论吸入H_2S对内毒素性急性肺损伤大鼠具有保护作用,抑制肺组织匀浆及血浆中炎性因子产生,促进负调控分子SIGIRR表达是可能的分子机制。

SIGIRR过表达抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞NF-κB的活化

目的:研究单免疫球蛋白白介素1受体相关蛋白(SIGIRR)对脂多糖(LPS)刺激的肺泡上皮细胞核因子-κB信号通路的调节作用。方法:以LPS刺激人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549。将含有SIGIRR cDNA全长的真核表达载体瞬时转染A549细胞,使SIGIRR在A549细胞过表达。用双萤光素酶报告系统检测LPS刺激后A549细胞NF-κB的转录活性,用ELISA法检测LPS刺激后细胞因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)以及白细胞介素-6(IL-6)的水平,对比转染与否对上述因子在A549细胞中释放水平的影响。结果:在A549细胞中,过表达SIGIRR可显著抑制NF-κB的转录活性,同时抑制LPS诱导的细胞因子IL-1β、TNF-α以及IL-6的表达。结论:SIGIRR过表达可以抑制LPS触发的肺泡上皮细胞中TLR4信号的转导,从而发挥减轻炎症反应、保护肺泡上皮细胞的作用。

SIGIRR过表达对LPS诱导的H292细胞NF-κB活性的影响

目的研究单免疫球蛋白白介素-1受体相关蛋白(SIGIRR)对内毒素(LPS)诱导的人气道上皮H292细胞核转录因子-κB(NF-κB)活性影响。方法将含有SIGIRR cDNA全长的真核表达载体瞬时转染H292细胞24 h后,用Western blot的方法检测SIGIRR在细胞内的表达水平,同时设立空载体转染组作为对照。另外,于转染24 h后给予LPS刺激,分别于加入LPS后3、6、12、24 h收集细胞质、细胞核蛋白和培养上清液,用Western blot的方法检测各时间点细胞质和细胞核中NF-κB蛋白水平变化,用ELISA的方法检测各时间点培养上清液中TNF-α和IL-6水平。结果在给予LPS刺激前,用质粒瞬时转染的方法使SI-GIRR在H292细胞中过表达可以显著抑制NF-κB的转录活性,同时抑制LPS诱导的细胞因子TNF-α和IL-6的产生。结论过表达SIGIRR可减轻H292细胞对LPS诱导的炎症反应,这可能与SIGIRR抑制LPS-TLR4信号传导而减少NF-κB的活化有关。调控SIGIRR的表达有望成为新的治疗急性肺损伤(ALI)等炎症失控性疾病的靶点。

SIGIRR对HMGB1诱导的A549细胞炎性反应的影响

目的观察单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR)对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)诱导的人肺泡上皮细胞株A549炎性反应的影响。方法构建含有SIGIRR cDNA全长的真核表达载体pCDNA3.1(+),瞬时转染人Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞,使SIGIRR在A549细胞中过表达,采用Western blot和RT-PCR法检测其表达。HMGB1刺激A549细胞后,双荧光素酶报告基因系统检测转染前后核转录因子κB(NF-κB)转录活性的改变,ELISA检测转染前后炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白表达水平的变化。结果转染SIGIRR表达载体的A549细胞,其SIGIRR表达量显著上升。HMGB1刺激后,双荧光素酶报告系统检测发现,NF-κB转录活性明显升高,而转染SIGIRR表达载体后NF-κB转录活性下降。ELISA实验结果表明,过表达SIGIRR的A549细胞在接受HMGB1刺激后其炎症因子TNF-α及IL-1β蛋白表达水平明显低于对照组。结论 SIGIRR表达上调可以抑制HMGB1诱导的A549细胞产生炎症因子TNF-α和IL-1β。A549细胞转染前后NF-κB转录活性的改变提示SIGIRR的抗炎作用可能与其参与NF-κB转录活性的调控有关。

单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白在脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠肺组织中表达的研究

目的通过构建小鼠急性肺损伤(ALI)模型,观察单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR)在正常小鼠及ALI小鼠模型肺组织中的表达规律,为SIGIRR在ALI预防及治疗方面的应用提供基础。方法将30只雄性BALB/C小鼠随机分为对照组及脂多糖(LPS)组,每组15只。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉满意后,行气管插管,呼吸机辅助呼吸。气管内缓慢滴入LPS溶液(1 mg/kg,500/μg)构建ALI模型。对照组按上述操作步骤,气管内注射人生理盐水。观察小鼠肺弹性阻力的变化;肺水肿程度观察;肺组织病理切片HE染色后光镜下观察肺组织病变情况;收集小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),FLSA法检测细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-6浓度;收集肺组织,ELISA法检测肺组织匀浆内一氧化氮(NO)浓度和髓过氧化物酶(MPO)活性;免疫组化检测肺组织中SIGIRR表达,Western blot检测各个时间点肺组织SIGIRR表达水平的变化。结果模型小鼠肺弹性阻力较对照组明显上升;模型小鼠肺组织湿/干重比值较对照组明显增高;模型小鼠肺组织的病理呈现典型的ALI病理改变特征,对照组小鼠则表现为正常的肺组织病理学特点;模型建立3 h后,ELISA法检测ALI小鼠BALF中IL-1β、TNF-α及IL-6浓度分别为(517±18)pg/mL.、(3523±168)pg/mL和(676±25)pg/mL,显著高于对照组(P<O.05);ELISA法检测模型小鼠肺组织匀浆液中NO的浓度和MPO的活性分别为(88.1±2.6)μmol/mL和(215±7)μIU/mL,显著高于对照组(P<0.05);免疫组化染色提示SIGIRR在正常的小鼠肺组织中存在表达,主要分布于肺泡及气道上皮细胞;模型小鼠肺组织Western blot结果表明:LPS诱导小鼠ALI后1h,SIGIRR的表达即开始下降,3 h后降至最低,随后缓慢恢复,至24 h时基本恢复正常表达水平。结论 SIGIRR在正常的小鼠肺组织中存在表达,主要分布于肺泡及气道上皮细胞,IPS诱导小鼠ALI后SIGIRR的表达短期内下降,至24 h后基本恢复正常表达水平。

SIGIRR在人正常肺组织及脂多糖诱导的肺泡上皮细胞急性损伤中的表达

目的检测单一免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR)在正常肺组织及脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞急性损伤中的表达。方法收集手术切除的正常肺组织标本20例,分别采用免疫组织化学、Western blot、RT-PCR法检测SIGIRR的表达。以终浓度10μg/mL的LPS刺激人Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞,于刺激前,刺激后3、6、12及24h分别以Western blot法检测SIGIRR表达的变化。将含有SIGIRR cDNA全长的表达载体瞬时转染A549细胞,使SIGIRR在A549细胞过表达。通过MTT法检测LPS对A549细胞的损伤作用。结果不同检测方法发现SIGIRR在正常肺组织中均有表达;免疫组织化学检测可见SIGIRR表达于肺泡上皮细胞。LPS刺激后3、6及12h时SIGIRR表达较刺激前均下调,24h后回升至刺激前水平。MTT试验表明过表达SIGIRR的A549细胞在接受LPS刺激后生长抑制率显著低于对照组。结论SIGIRR能够表达于正常肺组织,且能够减轻LPS刺激导致的肺泡上皮细胞损伤。提示SIGIRR可能参与了LPS诱导的ALI的调节。

小鼠SIGIRR基因重组腺病毒的构建及鉴定

拟构建小鼠SIGIRR基因重组腺病毒并进行鉴定,为SIGIRR在小鼠急性肺损伤预防及治疗方面的研究提供基础。利用AdEasyTM系统构建SIGIRR基因重组腺病毒,并检测SIGIRR mRNA及蛋白在感染细胞及组织中的表达。通过多次扩增后,大量制备高滴度腺病毒。结果表明,本试验成功构建了携带小鼠源性SIGIRR基因的重组腺病毒表达载体Ad-mSIGIRR,病毒感染滴度为5×1010 pfu/mL,滴度符合下一步试验要求。Western blot和免疫组化方法分别检测到mSIGIRR在体内的高效表达,且经气管滴注感染小鼠后,不会引起正常小鼠肺组织发生病理变化。明确了SIGIRR基因的重组腺病毒可以在小鼠活体内使mSIGIRR过表达,且经气管滴注5×109pfu的病毒感染小鼠后,不会引起正常小鼠肺组织发生病理变化。

单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白对香烟烟雾提取物刺激A549细胞后产生效应的影响

目的观察单免疫球蛋白白细胞介素1受体相关蛋白(SIGIRR)对香烟烟雾提取物(CSE)刺激的小鼠肺泡上皮细胞株A549炎性反应的影响。方法将A549细胞分为过表达SIGIRR组和对照组。构建含有SIGIRR c DNA全长的真核表达载体pc DNA3.1(+),瞬时转染小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞来源的A549细胞,使SIGIRR在A549细胞中过表达,采用半定量Western blot和RT-PCR法检测其表达。以CSE刺激对照组及过表达SIGIRR组中A549细胞后,ELISA法检测白细胞介素6(IL-6)水平,双荧光素酶报告系统检测环氧化酶2(COX-2)表达水平,化学发光法检测活性氧(ROS)释放水平的变化。结果转染SIGIRR表达载体的A549细胞其SIGIRR表达量显著上升。对照组经CSE刺激后,COX-2表达、ROS释放、IL-6释放水平均显著增高,而过表达SIGIRR组的A549细胞经CSE刺激后,COX-2表达较对照组降低,ROS释放较对照组降低,IL-6释放水平也明显低于对照组(P<0.05)。结论 SIGIRR表达上调可以抑制CSE诱导的A549细胞产生ROS、COX-2及IL-6,提示SIGIRR表达上调可能对吸烟所致呼吸道炎症具有抑制作用。