猪食道口线虫ITS-1和ITS-2rDNA的PCR-SSCP分析

以采自我国不同地区猪体的食道口线虫虫株为研究对象,PCR扩增出ITS-1和ITS-2序列片段,然后采用单链构象多态性(SSCP)方法分析PCR产物,对不同地区食道口线虫进行分子鉴定。所有样品经SSCP分析显示两种带型,第一种为有齿食道口线虫带型,另一种为未定种食道口线虫带型。代表性样品的测序结果表明,未定种食道口线虫带型的样品为四棘食道口线虫。本研究在国际上首次报道了中国猪四棘食道口线虫的ITS序列,并建立了区分有齿食道口线虫和四棘食道口线虫的PCR-SSCP方法,从而为食道口线虫的分子生物学的进一步研究奠定了基础。

PCR－SSCP分析实践

介绍了一种在一般实验室都能使用的适用于ＳＳＣＰ分析电泳的改良方法．并对如何设计引物、选择ＰＣＲ条件和分析结果进行了讨论．

SSCP技术解析硫酸盐还原反应器中微生物群落结构

采用改进的单链构象多态性(SSCP)技术,以16SrRNA基因的V3区为靶对象,分析完全混合式硫酸盐还原反应器中微生物的群落结构以及硫酸盐还原菌(SRBs)与产酸菌(ABs)的种间关系.共得到13个可辨晰的SSCP条带,对其中的6条带(A1,A3,A4,A5,A9,A10)进行了测序分析,分别同嗜柠檬酸明串球菌(GenBank登录号:AY453065,下同)、未培养细菌(AJ318147,AF227834,AJ576427)、产乙醇杆菌(AY434722)、梭杆菌(AB084627)等相似性较大.为检测系统中的SRBs,以SRBs富集培养基,对反应器中的活性污泥进行选择性富集,培养的混合菌群同样采用SSCP分析,带型与前者相差较大,其中有2条带与Bacteroidetes(AB074606)和脱硫弧菌(Y12254,U42221)最为相似.分析表明,SRBs在总DNA中的含量可能不到1·5%,但是它们与大量的ABs形成很好的种间协作关系,从而维持工艺系统较高的硫酸盐去除率和运行稳定性.

SSCP技术分析不同废水处理系统中微生物群落结构

为研究不同废水处理系统中微生物群落结构以及认识群落结构与系统处理效能的关系,采用单链构象多态性技术(SSCP)分别对稳定运行的脱氮除磷反应器(N),中药废水处理反应器(P),啤酒废水处理反应器(W),糖蜜废水发酵制氢反应器(H)以及硫酸盐还原反应器(S)等5种废水处理系统中的微生物群落结构进行了解析.结果表明,处理同种废水且状态均一的反应器中微生物群落结构相似性最大;微生物种群多样性与废水中的有机质复杂性成正相关,中药废水由于含有较复杂的有机质成分,种群多样性最高,而人工配水的处理系统由于营养成分单一,种群多样性较低;与模式群落中微生物SSCP条带比较显示,某些功能微生物类群在整个系统中相对数量并非占优势,发酵产氢菌Ethanologenbacteriumsp.在状态良好的制氢反应器中相对含量仅占5%,而脱硫弧菌Desulfovibriosp.在硫酸盐还原反应器中的相对比例小于1.5%.SSCP指纹图谱技术能够揭示不同处理系统中微生物群落结构的差别,并对这些工艺中的部分功能微生物进行监测,进而为提高反应器的运行效果提供有益的指导.

应用RT/PCR-SSCP法分析传染性法氏囊病病毒的变异性

根据传染性法氏囊病病毒 ( IBDV) c DNA序列 ,在病毒 VP2区域设计 1对引物 ,应用 RT/PCR-SSCP方法对 4个不同时间及不同地域从传染性法氏囊病 ( IBD)病鸡法氏囊组织中分离的 IBDV分离物进行了分析 ,发现 4个 IBDV分离物的 SSCP图谱均存在明显差异。本试验表明 ,IBDV变异在我国普遍存在 ,SSCP方法可用于 IBDV的变异性分析。

生物陶粒与生物活性炭上微生物群落结构的PCR-SSCP技术解析

采用PCR-SSCP(单链构象多态性)技术,以16S rRNA基因的V4-V5区为靶对象,分析用于饮用水处理的生物陶粒和生物活性炭上的微生物群落结构.对生物陶粒和生物活性炭上的微生物分别进行超声波洗脱、R2A和LB平板培养后提取基因组DNA.结果表明,除生物活性炭超声波洗脱不能提取到DNA外,其他处理均能提取到大小在10 kb以上的基因组DNA,但所提取的量有较大差异.以提取的DNA为模板分别进行PCR,均能扩增到408 bp的基因片段.这些片段经λ核酸外切酶消化处理后进行SSCP电泳.结果显示,超声波洗脱、R2A和LB培养对试验结果影响不明显.生物陶粒的微生物基因扩增片段SSCP图谱相同,且只出现1条带.测序后与基因组数据库对比,结果显示其与uncultured Pseudomonas sp.clone FTL201 16S rDNA(GenBank登录号AF509293.1)片段同源性为92%.生物活性炭的微生物基因扩增片段SSCP图谱也相同,但有2条带.测序对比的结果表明,这2个基因片段与Bacillus sp.JH19 16S rDNA(GenBank登录号DQ232748.1)片段和Bacterium VA-S-11 16S rDNA(GenBank登录号AY395279.1)片段的同源性分别为100%和99%.

绵羊PRNP等位基因PCR-SSCP分析条件的优化

为进行绵羊PRNP等位基因密码子136、154、171的多态性研究,建立适合于绵羊PRNP等位基因开放阅读框(ORF)内高变区PCR-SSCP分析方法,对凝胶浓度、交联度、甘油浓度、电泳电压、电泳时间、PCR产物与变性缓冲液比例、电泳缓冲液浓度、上样量等影响因素进行了优化试验。在优化中引入了正交试验法,以使优化过程简化,结果可靠。结果表明,交联度49∶1、甘油浓度0%、凝胶浓度12%、电泳电压200 V、PCR产物上样量≥2.0μL且<4.0μL、PCR产物与变性缓冲液比例1∶4、0.5×TBE缓冲液及4℃电泳45 h为最佳试验条件,据此建立了绵羊PRNP等位基因136、154、171密码子的PCR-SSCP分析方法。

斑节对虾Sox基因HMG盒的PCR扩增及SSCP分析

SRY基因是人类及哺乳动物睾丸决定因子的最佳候选基因,HMG盒是SRY基因编码蛋白质的唯一功能区,在性别决定中极其重要且高度保守,许多进化程度上明显不同的物种中都能检测出SRY基因的HMG盒,即Sox基因。斑节对虾是一种重要经济虾类,其性别决定机制研究薄弱,至今未找到性染色体。本研究根据人的SRY基因的HMG盒保守区的核苷酸序列,设计了1对兼并引物,通过PCR扩增出斑节对虾的Sox基因,并对扩增产物进行SSCP分析。结果表明,斑节对虾雌雄个体均存在Sox基因,从雌雄个体中均扩增出约350bp和220bp两条基因片段,推测其中350bp片段含内含子,SSCP结果显示斑节对虾内存在Sox基因家族的不同成员,且雌雄存在差异。最后我们讨论了对虾性别决定可能的机制。

PCR-SSCP检测非霍奇金淋巴瘤患者骨髓克隆性T细胞受体基因重排及其临床意义

背景与目的:进一步了解非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkinslymphoma,NHL)患者骨髓标本克隆T细胞受体(Tcellreceptor,TCR)基因重排情况及临床意义。方法:应用聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)联合单链构象多态性(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)分析43例NHL患者骨髓标本TCRVγI-Jγ基因重排情况。结果:43例NHL患者有26例(60.5%)存在克隆性TCRVγI-Jγ基因重排。16例骨髓形态学检查未发现淋巴瘤细胞浸润者中有3例(18.8%)发现克隆性TCRVγI-Jγ基因重排,此3例患者分别于4～9个月后行骨髓形态检查时发现淋巴瘤细胞浸润;27例骨髓形态学检查有淋巴瘤细胞浸润者有23例(85.2%)存在克隆性TCRVγI-Jγ基因重排阳性。26例PCR扩增阳性病例经SSCP分析发现7例(26.9%)存在寡/亚克隆重排。7例存在寡/亚克隆重排患者经3～11个月有5例(71.4%)发展为白血病,存在寡/亚克隆重排NHL患者1年内转化为白血病的发生率显著高于无寡/亚克隆重排患者(10.5%)(P<0.005)。结论:应用PCR检测NHL患者骨髓标本克隆性TCRVγI-Jγ基因重排可较骨髓形态学检查更早发现NHL患者骨髓浸润微小病灶。具有寡/亚克隆NHL患者更易发展为白血病,还可发展为急性非淋巴细胞白血病。

绵羊LHR基因PCR-SSCP多态性与繁殖性状的关联分析

通过聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析方法检测绵羊品种(湖羊、晋中绵羊和陵川半细毛羊)促黄体素受体(luteinizing hormone receptor,LHR)基因外显子11核酸序列的单核苷酸多态性,并研究该基因多态性对湖羊性早熟和产羔数的影响。结果表明:在6对引物扩增产物中,只有引物P2和P6的扩增片段具有多态性,引物P2扩增区存在2种基因型,分别为LL和LM型,在3个绵羊品种中均未检测到MM型;引物P6扩增区存在6种不同的SSCP带型,经序列比对分析存在T2053A、A2044T和G2003A的错义突变。湖羊和晋中绵羊P2扩增区基因型分布差异不显著(P>0.05),而与陵川半细毛羊均存在极显著差异(P<0.01);P6扩增区的2 053、2 044、2 003位点各基因型分布在湖羊和晋中绵羊间差异不显著(P>0.05),而与陵川半细毛羊间存在显著差异。P2扩增位点仅陵川半细毛羊的基因分布不符合哈迪-温伯格定律;P6扩增区湖羊和晋中绵羊在各突变位点的等位基因频率处于群体平衡状态,陵川半细毛羊除2 003突变位点基因分布处于群体不平衡状态外,其余突变位点的等位基因频率分布符合哈迪-温伯格定律;LHR外显子11区不同基因型湖羊各胎次产羔数差异不显著(P>0.05),表明LHR外显子11对湖羊的性早熟和高繁殖力性状没有显著影响。

凝胶组成对小麦SSCP技术的影响

SSCP技术易受凝胶浓度、丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例和添加物等诸多因素的影响。本研究探讨了凝胶中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例、凝胶浓度和添加物等。结果显示:凝胶中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29∶1、凝胶浓度为12%、凝胶中不添加蔗糖和甘油为最佳的凝胶组成,单链DNA条带清晰,杂带少,容易观察。

德保矮马生长激素受体基因PCR-SSCP分析

为了研究德保矮马生长激素受体(GHR)基因的多态性,试验根据GenBank公布的马GHR基因样序列设计了9对特异性引物,PCR扩增出德保矮马GHR基因的9个外显子片段(eoxn 2～10),单链构象多态性(SSCP)分析这些片段多态性,并进行群体遗传学分析。结果表明:德保矮马GHR基因9个片段中有3个片段表现出聚合酶链式反应-单链构象多态性,即E1、E3和E5,其他6个片段无多态性。E1片段表现为3种基因型AA、GG和AG型,GG型为优势基因型,G为优势等位基因;E3片段表现出4种基因型,即AA、AC、GA和GC,GA为优势基因型,A、G为优势等位基因;E5片段表现出3种基因型,即AA、AG和GG型,GG为优势基因型,G为优势等位基因。GHR基因E1、E3、E5片段均为中度多态;E1和E3片段处于Hardy-Weinberg非平衡状态,E5处于平衡状态。

应用PCR-SSCP银染技术分析胃癌p53基因的点突变

目的 分析胃癌中p5 3基因第 5～ 8外显子点突变的发生及其意义。方法 应用聚合酶链反应 单链构象多态性分析(PCR SSCP)和银染技术 ,对 40例胃良性疾病和 3 0例胃癌标本中 p5 3基因第 5～ 8外显子的点突变情况进行检测。 结果 40例胃良性疾病均无点突变发生 ,3 0例胃癌中有 12例发生 p5 3基因的点突变 ,突变率为 40 .0 0 % (12 /3 0 )。 结论 p5 3基因突变与胃癌的发生密切相关 ;PCR SSCP银染技术不仅灵敏安全 ,而且简便、快速、重复性好 。

利用PCR-SSCP及克隆分析对HERG基因突变的新发现(英文)

为研究ＱＴ延长综合征（ＬＱＴＳ）致病的分子遗传学基础。我们在ＰＣＲ基础上建立ＳＳＣＰ方法对ＬＱＴ患者和正常对照者ＨＥＲＧ基因的突变进行研究。并且利用克隆技术对突变进行确证。通过ＳＳＣＰ分析，在１例正常对照者中发现异常条带，该突变无法用直接测序确证，因此我们将其转入质粒，克隆后再进行测序。结果提示在ＨＥＲＧ基因７５２位点（５′→３′）异常插入９个碱基。突变型为杂合子。突变导致蛋白通道氨基酸序列中插入ＧｌｙＡｌａＧｌｙ。与其他已报道的突变不同，本文所发现的３个氨基酸的插入突变不是ＬＱＴＳ发生的遗传基础。

PCR-SSCP法检测结核分枝杆菌L型rpsL耐药基因

目的探索尘肺结核患者感染的结核分枝杆菌(MT)L型的耐药基因rpsL突变与耐受链霉素(SM)的关系。方法用PCR-SSCP方法检测rpsL基因,与采用常规SM药敏试验(AST法)的结果进行对比分析。结果采用AST法检测,52株结核分枝杆菌L型临床分离株中共有26株(50.0%)耐SM;PCR-SSCP法检出rpsL基因突变率为40.4%(21/52),2种方法检测耐药株的符合率为80.8%。结论结核杆菌L型对SM的耐药与rpsL基因突变有关。

PCR-SSCP检测大肠癌组织中p53、K-ras基因的突变

目的 探讨p5 3、K -ras基因突变与大肠癌发生、发展的关系。方法 应用PCR -SSCP方法检测 68例大肠癌和癌旁组织以及 2 0例正常组织中 p5 3、K -ras基因突变情况。 结果 大肠癌组织中 p5 3、K -ras基因突变率分别为 47.1% (3 2 68)和44 .1% (3 0 68) ,明显高于癌旁组织 (13 .2 % ,9 68;7.4% ,5 68) ,2 0例正常组织中未检出 p5 3、K -ras基因突变。伴有淋巴结及远处转移的大肠癌者 ,其 p5 3、K -ras基因突变率明显高于无淋巴结及远处转移者 ;p5 3、K -ras基因突变与大肠癌组织学类型无关。结论 p5 3、K -ras基因突变与大肠癌发生、发展有密切关系 ,其在细胞癌变中起重要作用 ,可作为评估大肠癌转移的分子生物学指标之一。

凝胶浓度对SSCP技术的影响

SSCP技术易受凝胶浓度、丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例和添加物等诸多因素的影响。本研究探讨了凝胶中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例、凝胶浓度和添加物等对海胆SSCP技术的影响。结果显示:凝胶中丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的比例为29∶1、凝胶浓度为10%、凝胶中甘油为最佳的凝胶组成,单链DNA条带清晰,杂带少,容易观察。

PCR－SSCP用于HLA－DR4等位基因多态性研究

采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－单链构象多态性（ＳＳＣＰ）技术，分析了８例已知ＤＲ４等位基因型的个体，其中７例不同基因型的样本ＳＳＣＰ图谱有明显区别，２例均为ＤＲＢ１＊０４１０的样本，ＳＳＣＰ图谱则完全一致。笔者着重探讨了影响ＳＳＣＰ分析的主要因素：聚丙烯酰胺凝胶浓度和交联度，凝胶中是否含甘油，电泳温度、电流或电压大小等。提示ＰＣＲ－ＳＳＣＰ可用于研究ＨＬＡ的微观多态性、器官移植的配型及法医学上个体识别等方面，具有简便，快速、经济以及高度的分辨力和良好的重复性。

PCR-SSCP检测肥厚型心肌病心肌肌钙蛋白Ⅰ基因7号外显子突变

目的研究聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)法检测肥厚型心肌病心肌肌钙蛋白I(cTnI)基因7号外显子突变的可行性。方法肥厚型心肌病患者59例(2例曾直接测序证实7号外显子Arg145Trp突变),PCR扩增cTnI基因7号外显子,予PCR-SSCP检测突变,与直接测序结果进行比较。结果2例Arg145Trp突变者均有异常条带,余未证实突变者未见阳性条带。结论PCR-SSCP检测肥厚型心肌病cTnI基因Arg145Trp突变具有良好的检出性,可作为大规模人群筛查的工具。

PCR-SSCP在恶性血液病N-ras癌基因点突变检测中的应用

目的：检测血液系统肿瘤中Ｎ－ｒａｓ癌基因点突变的活性。方法：采用ＰＣＲＳＳＣＰ技术分析了２８例恶性血液病Ｎｒａｓ基因的突变活性，包括：ＡＮＬＬ６例，ＡＬＬ１２例，ＨＤ２例，ＮＨＬ３例，ＭＤＳ５例。结果：２８例中ＰＣＲＳＳＣＰ检测与正常对照，发生阳性者４例（１４．６％），其中ＡＬＬ１例（８．３％）、ＡＮＬＬ１例（１６．６％）、ＭＤＳ２例（４０％）。４例中有２例临床缓解后持续阳性，１例为ＡＬＬ患者，于骨髓移植后１０４ｄ复发死亡。１例ＭＤＳ患者转化为急性白血病，另２例临床缓解后３个月检测转阴，其中１例为ＡＮＬＬ，１例为ＭＤＳ。结论：ＰＣＲＳＳＣＰ方法可作为一种癌基因点突变检测手段常规应用于临床，但值得注意的是，ＰＣＲＳＳＣＰ方法只能提供分析区域是否存在突变点。