转录因子Skn-1a激活人乳头瘤病毒18 E6基因表达的分析

用脂质体介导真核表达质粒pcDNA3-skn-1a转染Hela细胞,实时定量PCR检测HPV18 E6基因的表达量,以探讨转录因子Skn-1a对HPV18 E6基因表达的调控.结果显示Skn-1a能够显著激活HPV18 E6基因表达,为高发宫颈癌E6基因调控的分子机理探讨提供理论依据.

宫颈癌组织中转录因子Skn-1 a cDNA的克隆及表达

目的:从宫颈癌组织中扩增与上皮细胞分化和人乳头瘤病毒(HPV)基因表达相关的转录因子Skn-1acDNA,进而在真核细胞中表达该转录因子以了解其功能。方法:从宫颈癌组织中提取总RNA,以此为模板,RT-PCR扩增Skn-1acDNA片段,将该cDNA片段克隆至pMD18-T载体并进行序列分析,构建Skn-1a真核表达载体,并转染Hela细胞,检测其表达情况。结果:RT-PCR扩增得到约1 300 bp的cDNA片段,将其克隆至pMD18-T载体,DNA测序表明,得到片段长度为1 308 bp,为转录因子Skn-1a基因编码的cDNA,获得的Skn-1acDNA序列与已公布的Skn-1acDNA序列具有99.85%同源性,有1个碱基的差异,但并未导致编码氨基酸的改变,继而构建了Skn-1a真核表达载体pcDNA3/Skn-1a,其转染Hela细胞后可正确表达。结论:转录因子Skn-1a在宫颈癌组织中有一定量的表达,并在体外培养的Hela细胞中获得表达。

白术乙醇提取物对秀丽隐杆线虫寿命的影响及其机制研究

目的:研究白术乙醇提取物(AM)对秀丽隐杆线虫(简称“N2线虫”)寿命的影响,并基于转录因子SKN-1/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路探讨其作用机制。方法:将N2线虫分为空白对照组、阳性对照组(100μmol/L姜黄素,下同)和AM低、中、高剂量组(100、200、300μg/mL,下同),考察正常、氧化应激(40 mmol/L H2O2)条件下AM对N2线虫寿命的影响(以平均存活时间计)以及正常条件下AM对N2线虫繁殖能力的影响(以子代数量计)。用700μmol/L H2O2建立小鼠神经瘤母细胞N2a氧化应激模型,采用MTT法考察阳性对照和AM低、中、高剂量对模型细胞存活率的影响。人胚胎肾上皮细胞293T转染Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)质粒后,采用荧光素酶报告基因法考察阳性对照和AM低、中、高剂量作用24 h以及AM中剂量作用12、18、24 h对Nrf2-ARE荧光素酶活性的影响。采用实时定量聚合酶链式反应法考察阳性对照和AM低、中、高剂量对N2a细胞中Nrf2下游抗氧化基因NQO-1、HO-1 mRNA表达以及对N2线虫中SKN-1下游抗氧化基因GCS-1、GST-7、GST-10、HSP-60、HSP-16.2、SOD-3 mRNA表达的影响。结果:与空白对照组比较,阳性对照组和AM各剂量组N2线虫在正常、氧化应激下的平均存活时间均显著延长,第1天子代数量(除AM高剂量组外)、第2天子代数量(除AM低剂量组外)和总子代数量(除AM低剂量组外)均显著增加(P<0.05或P<0.01)。阳性对照组和AM中、高剂量组N2a细胞存活率显著高于模型组(P<0.05或P<0.01)。与空白对照组比较,阳性对照组和AM各剂量组293T细胞中Nrf2-ARE荧光素酶相对活性以及AM中剂量组293T细胞培养不同时间的Nrf2-ARE荧光素酶相对活性均显著增强(P<0.01),并有剂量依赖性和时间依赖性趋势。与空白对照组比较,阳性对照组和AM各剂量组N2a细胞/线虫中HO-1、NQO-1(除阳性对照组外)、GCS-1(除AM低剂量组外)、GST-7(除阳性对照组和AM低剂量组外)、GST-10、HSP-60(除AM低剂量组外)、HSP-16.2(除阳性对照组和AM低剂量组外)、SOD-3(除阳性对照组和AM低剂量组外)mRNA的相对表达量均显著升高(P<0.05或P<0.01)。结论:AM可延长N2线虫在正常和氧化应激状态下的寿命,并可提高线虫的繁殖能力,其作用机制可能与激活SKN-1/Nrf2信号通路有关。