绵羊SMAD 4基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】克隆绵羊SMAD同源物4(SMAD4)基因并探究其在绵羊中的生物学功能,为研究SMAD 4基因在毛囊生长发育过程中的调控作用提供依据。【方法】以小尾寒羊皮肤组织cDNA为模板,PCR扩增SMAD 4基因CDS区并克隆测序,对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR检测SMAD 4基因在小尾寒羊和新吉细毛羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、皮肤和肌肉中的表达量。【结果】试验成功克隆小尾寒羊SMAD 4基因CDS区,长1662 bp,编码553个氨基酸。系统进化树分析显示,绵羊SMAD 4基因核苷酸序列与山羊和牦牛的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远。生物信息学分析发现,SMAD4蛋白为不含信号肽的非跨膜蛋白,存在磷酸化和糖基化位点,属于亲水性蛋白,主要存在于细胞核中;SMAD4蛋白二级结构以无规则卷曲为主,与三级结构预测结果一致;蛋白互作分析显示,SMAD4蛋白与SMAD2、SMAD1、TGFBR1、TGFBR2、SMAD3等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果显示,SMAD 4基因在绵羊中广泛表达;与新吉细毛羊相比,小尾寒羊心脏、脾脏和皮肤中SMAD 4基因表达量均显著上升(P<0.05),而肺脏和肌肉中SMAD 4基因表达量均显著下降(P<0.05)。【结论】试验成功克隆绵羊SMAD 4基因CDS区,该基因在绵羊各组织中均有表达,且在小尾寒羊和新吉细毛羊心脏、脾脏、皮肤、肺脏和肌肉中存在显著差异。试验结果为进一步探究绵羊SMAD 4基因调控毛囊发育提供理论依据。

mir-130a-3p及smad 4在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

目的考察mir-130a-3p及靶基因smad 4在肝细胞癌(HCC)组织中表达及相关性,并分析两者表达与肝癌临床病理特征和预后的关系。方法从石蜡组织包埋的51例肝癌组织及相应癌旁组织中提取总RNA,应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测mir-130a-3p的表达,并采用免疫组织化学Eli Vision(IHC)法测定肝癌组织及癌旁组织中smad 4表达,分析两者相关性、与临床病理参数及总生存时间(OS)之间的关系。结果 mir-130a-3p在肝癌组织中的表达水平(1.38±0.15)显著低于癌旁组织(2.48±0.16)(P<0.001)。在肝癌组织中,smad 4阳性表达率为72.5%(37/51),明显高于癌旁组织51.0%(26/51)(P<0.05)。mir-130a-3p和smad 4在肝癌组织中的表达呈负相关性(rs=-0.431,P<0.05)。mir-130a-3p和smad 4的表达水平与肝癌患者TNM分期有关(P<0.05),与年龄、性别、有无淋巴结转移、有无脉管癌栓及病理分级无关。肝癌组织中mir-130a-3p高表达患者中位OS(25.6个月)较低表达组(23.1个月)延长,但差异无统计意义;smad 4阴性表达组中位OS(26.7个月)较阳性表达组(20.0个月)显著延长(P<0.05)。结论 mir-130a-3p在肝癌组织中表达下调,可能通过调控smad 4的表达参与了肝癌的发生发展,mir-130a-3p有望成为肝癌潜在的治疗靶点及预后判断因子。

Smad 2/3和Smad 4在子宫内膜癌中的表达及其相关性

目的研究Smad2/3和Smad4在子宫内膜癌组织中的表达情况及二者的相关性。方法采用免疫组化S-P法检测Smad2/3和Smad4在正常子宫内膜组织、非典型增生子宫内膜组织及子宫内膜癌中的表达。结果 Smad2/3和Smad4在子宫内膜癌中的表达阳性率均明显低于正常子宫内膜组织和非典型增生子宫内膜组织,差异均有统计学意义(P<0.05)。子宫内膜癌中Smad2/3的表达与手术-病理分期无关(P>0.05),与组织学分级有关,随组织学分级的增加其表达减少(P<0.05);Smad4的表达与手术-病理分期及组织学分级均无关(P>0.05)。子宫内膜癌中Smad2/3与Smad4的表达呈正相关(P<0.05)。结论 Smad2/3与子宫内膜癌的分化有关,Smad4与子宫内膜癌的恶性程度无直接相关,在已发生癌变的组织中可能不参与子宫内膜癌的侵袭及演进。Smad2/3与Smad4可能协同参与了子宫内膜癌的发生发展,联合检测Smad2/3与Smad4蛋白可能有助于评价子宫内膜癌的恶性程度及预后。

口腔扁平苔藓中TGF-β1、Smad 4和Cyclin D1的表达研究

目的:观察口腔扁平苔藓中TGF-β1,Smad4和Cyclin D1的表达变化。方法:取10例糜烂型OLP病人口腔黏膜,20例网状型OLP病人口腔黏膜,10例非炎症手术病人的正常口腔黏膜,制作病理切片,进行TGF-β1、Smad4和Cyclin D1免疫组化SABC法染色,观察比较不同类型OLP时TGF-β1、Smad4和CyclinD1在口腔黏膜中的表达变化。结果:TGF-β1和Cyclin D1在糜烂型OLP中表达均略高于网状组,但差异均无统计学意义(P>0.05);而Smad4蛋白在两种类型OLP中的表达相近,亦无显著性差异(P>0.05)。无论糜烂型OLP组还是网状型OLP组,TGF-β1、Smad4和Cyclin D1三种蛋白的表达量均明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:TGF-β1、Smad4、Cyclin D1在OLP中表达升高,提示三者在OLP的发生及发展过程中起着重要作用。

Smad 4在贲门及非贲门癌中的表达及其与生存的关系

目的:研究Smad4在胃贲门和非贲门癌中的表达状况,分析其表达与临床病理特征及生存之间的关系,探讨贲门癌的发病机制.方法:应用免疫组化及组织芯片技术,对78例贲门癌、113例非贲门癌组织中的Smad4蛋白表达情况进行分析.结果:贲门及非贲门癌中Smad4蛋白的阳性表达率分别为67.9%和66.4%.在贲门癌中Smad4蛋白表达与患者年龄及分化程度有关(P<0.05);在非贲门癌中Smad4的表达与各临床病理特征均无相关性(均P>0.05).生存分析表明,Smad4表达仅与非贲门癌患者的预后有关(P=0.010).结论:在胃贲门和非贲门癌中Smad4的表达对患者临床病理特征的影响不尽相同.Smad4蛋白表达对非贲门癌患者的预后有一定的作用.贲门胃癌不仅在分子水平上同非贲门癌存在差异,在生存预后方面亦存在不同.

转化生长因子β受体Ⅰ、Ⅱ和Smad 4在胃癌中的表达及其临床意义

目的胃癌是世界上最为常见的恶性肿瘤之一,预后较差,是人类主要的肿瘤致死病因。本研究旨在探讨转化生长因子β受体Ⅰ、Ⅱ(TβRⅠ、Ⅱ)和Smad 4 mRNA与胃癌发生、发展的关系。方法采用免疫组织化学和分子原位杂交的方法对67例胃癌、24例正常胃粘膜的TGFβ1蛋白和Smad 4 mRNA表达进行检测。结果胃癌组织中TβRⅠ、Ⅱ蛋白和Smad 4 mRNA表达率(分别为73.13%、49.25%和44.78%)较正常黏膜(均为95.83%)相比,均明显减弱(P<0.05)。TβRⅠ蛋白的表达与胃癌的临床病理因素无关(P>0.05),TβRⅡ蛋白和Smad 4 mRNA在胃癌中表达的变化与胃癌的临床病理因素有关(P<0.05)。TβRⅡ蛋白和Smad 4 mRNA在胃癌中表达的变化呈明显的负相关(P<0.05)。结论TβRⅡ蛋白和Smad 4 mRNA的低表达对细胞的恶性转化及增殖有一定的生物学意义。

TGFβ1与Smad 4基因在肝细胞癌中的表达及意义

目的探讨TGFβ-Smad信号通路中TGFβ1与Co-Smad(Smad 4)与肝细胞癌的发生、发展的关系。方法采用免疫组化ABC法及原位杂交法(ISH),检测41例肝细胞癌组织与癌旁组织中TGFβ1、Smad 4蛋白、Smad 4 mRNA的表达,以5例外伤性肝破裂手术切除标本作为正常对照。比较HCC组与对照组及HCC癌旁中TGFβ1与Smad 4蛋白、Smad 4 mRNA表达的差异,并进行图像分析。结果正常对照组中TGFβ1呈阴性表达,Smad 4蛋白、Smad 4 mRNA均呈阳性表达;HCC组织中TGFβ1阳性表达率为78.0%(32/41),癌旁组织中为95.1%(39/41),两者比较差异显著(P<0.05);Smad 4蛋白在HCC组织中阳性表达率为48.8%(20/41),在癌旁组织中为78.0%(32/41),两者比较有显著性差异(P<0.01);Smad 4 m RNA在HCC组织中阳性表达率为51.2%(21/41),在癌旁组织中为73.1%(30/41),两者比较有显著性差异(P<0.05);与正常肝组织比较,HCC组织中Smad 4蛋白和Smad 4 mRNA阳性表达率均显著降低(P<0.05);Ⅰ、Ⅱ级HCC组织与Ⅲ、Ⅳ级HCC组织Smad 4 m RNA阳性表达存在显著差异(P<0.05),Ⅲ、Ⅳ级阳性表达率较Ⅰ、Ⅱ级降低;Smad 4蛋白的阳性面积百分比、光密度及Smad 4 m RNA的阳性面积百分比癌旁组织均显著高于HCC组织(P均<0.05)。HCC组织中Smad 4蛋白、Smad 4 m RNA表达与TGF-β1表达比较均存在显著差异(P<0.05),但均无显著相关性(P>0.05)。结论TGFβ1过表达、Smad 4表达缺失可能在肝细胞癌的发生、发展中发挥重要作用。

TGF-β1和smad 4mRNA在慢性病毒性肝炎、肝硬化组织中的表达及意义

应用免疫组化和原位杂交方法,对10例对照肝组织,70例慢性病毒性肝炎、肝硬化肝组织TGF - β1和smad4mRNA的表达进行检测,结果TGF - β1和smad4mRNA在慢性病毒性肝炎肝硬化中的表达明显增强,smad4mRNA阳性率分别为87 .5 %、82 . 6 % ,TGF - β1阳性率分别为83. 33%、86 . 96 % ;TGF - β1和smad4mRNA阳性表达细胞在肝组织切片中的分布多集中在扩大的汇管区、中央静脉及窦周周围(间质细胞及肝细胞内均见有表达) ,提示TGF - β1与smad4mRNA的表达与肝纤维化活动状态密切相关,TGF - β/smad通路在肝纤维化的形成和发展中具有重要意义。

Smad 4基因在鼻咽癌CNE2细胞中的突变分析

目的:研究CNE2细胞中Smad4基因的突变。方法:运用RT-PCR方法从CNE2细胞中克隆人Smad4cDNA序列,然后与正常鼻咽组织及GenBank序列进行比较分析。结果:CNE2细胞中Smad4基因没有发生任何形式的突变。结论:CNE2细胞可能是一种非Smad4突变的恶性肿瘤,构建的含有人Smad4编码序列的重组质粒,为今后开展Smad4基因的功能研究奠定了基础。

牦牛Smad 4基因3′UTR区双荧光素酶载体构建及与bta-miR-146a的靶向验证

旨在鉴定牦牛Smad4基因与bta-miR-146a的靶向关系,为探究它们在牦牛卵巢卵泡发育过程中的可能分子调控机制提供理论基础。利用miRBase数据库和MEGA 6.0软件分析miR-146a在不同物种中的保守性,同时利用TargetScan软件预测其潜在靶基因,通过构建psiCHECK2双荧光素酶报告基因载体进行靶向验证。生物信息学分析结果显示,miR-146a成熟序列在脊椎动物中具有高度的保守性,并预测到178个与卵巢卵泡发育相关的潜在靶基因,从中选取Smad4基因分析发现其3′非编码区域(3′UTR)与bta-miR-146a存在结合位点;进一步成功构建牦牛Smad4基因3′UTR野生型及突变型psiCHECK2双荧光素酶报告质粒,荧光素酶活性检测结果显示,bta-miR-146amimic对牦牛Smad4基因3′UTR野生型报告质粒荧光活性有明显的下调作用,分别与突变型及NC对照组差异显著(P<0.05)。本研究初步证实,牦牛Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因,从而提示btamiR-146a可能通过调控Smad4基因在牦牛卵巢卵泡发育过程中的表达发挥作用。

miR-146a-5p、SMAD4在甲状腺滤泡癌组织中表达变化和对FTC-238细胞系增殖迁移侵袭影响及靶向关系

目的通过观察甲状腺滤泡癌(FTC)组织中miR-146a-5p、SMAD4的表达变化及对细胞增殖、迁移、侵袭能力的影响,分析miR-146a-5p与SMAD4之间的靶向关系,以探讨miR-146a-5p是否通过靶向SMAD4促进FTC增殖、迁移、侵袭。方法收集FTC组织标本30例份,非肿瘤甲状腺或距离肿瘤边缘>2 cm癌旁组织30例份,采用RT-qPCR法检测FTC组织及癌旁组织中miR-146a-5p、SMAD4 mRNA。将FTC-238细胞系分为miR-146a-5p mimics组和阴性对照(miR-NC组)分别转染miR-146a-5p mimics(使细胞过表达miR-146a-5p)及miR-NC。采用CCK8法观察两组培养12、24、48 h时的细胞增殖能力,划痕实验观察两组细胞迁移能力,Transwell小室实验观察两组细胞侵袭能力。分别采用RT-qPCR及免疫印迹法检测两组细胞中SMAD4 mRNA及蛋白。双荧光素酶报告基因实验验证miR-146a-5p与SMAD4的靶向关系。结果与癌旁组织相比,FTC组织中miR-146a-5p相对表达量降低(P<0.05);SMAD4 mRNA相对表达量升高(P<0.05)。与miR-NC组相比,各个时间点miR-146a-5p mimics组细胞OD值降低(P均<0.05);与miR-NC组相比,miR-146a-5p mimics组细胞迁移、侵袭数目减少(P均<0.05)。与miR-NC组相比,miR-146a-5p mimics组SMAD4 mRNA及蛋白相对表达量降低(P均<0.05)。miR-146a-5p与SMAD4存在靶向关系。结论FTC组织中miR-146a-5p表达降低、SMAD4表达升高;miR-146a-5p过表达可抑制FTC-238细胞系增殖、迁移、侵袭;miR-146a-5p与SMAD4之间存在靶向关系。miR-146a-5p可能通过靶向抑制SMAD4促进FTC癌细胞的增殖、迁移、侵袭。

绝经后女性患者血清Smad4和Osterix水平与骨密度及骨折发生率的相关性分析

目的分析绝经后女性患者血清Smad同源物4(Smad4)和成骨细胞特异性转录因子(Osterix)水平与骨密度(BMD)及骨折发生率的相关性。方法选取2020年5月至2022年5月西安交通大学第二附属医院收治的157例45~70岁绝经女性作为研究对象,按BMD将患者分为BMD正常组(n=51)、BMD减少组(n=59)、骨质疏松症(OP)组(n=47);根据是否骨折分为骨折组(n=48)和非骨折组(n=109)。检测研究对象血清Smad4、Osterix、β胶原降解产物(β-CTX)、Ⅰ型胶原氨基端延长肽(P1NP)、骨桥蛋白(OPN)及N端骨钙素(N-MID)水平;分析血清Smad4与Osterix的相关性,及血清Smad4、Osterix与骨代谢指标间的相关性,以及影响患者发生OP的因素。绘制受试者工作特征(ROC)曲线分析血清Smad4、Osterix水平对发生骨折风险的预测价值。结果与BMD正常组比较,BMD减少组和OP组的β-CTX、P1NP、OPN、N-MID依次升高,股骨BMD、腰椎L1-4BMD依次降低(P<0.05);BMD减少组和OP组的血清Smad4和Osterix水平依次降低(P<0.05);OP组骨折发生率显著高于BMD正常组和BMD减少组(P<0.001),BMD减少组骨折发生率显著高于BMD正常组(P=0.027)。骨折组的血清Smad4、Osterix水平显著低于非骨折组(P<0.05)。Pearson分析结果表明,Smad4和Osterix的表达水平呈正相关(P<0.05);Spearman分析结果表明,Smad4表达水平与β-CTX、P1NP、OPN和N-MID呈负相关(P<0.05),与股骨BMD和腰椎L1-4BMD呈正相关(P<0.05);Osterix的表达水平与β-CTX、P1NP、OPN和N-MID呈负相关(P<0.05),与股骨BMD和腰椎L1-4BMD呈正相关(P<0.05)。多因素Logistic回归分析表明,低水平Smad4、Osterix、股骨BMD、腰椎L1-4BMD是影响OP发生的危险因素(P<0.05)。绘制ROC曲线结果显示,血清Smad4预测骨折风险的曲线下面积(AUC)为0.937,血清Osterix预测骨折风险的AUC为0.911,二者联合预测骨折风险的AUC为0.974,二者联合优于血清Smad4和Osterix各自单独诊断(Z联合vs.Smad4=3.843、Z联合vs.Osterix=2.386,P<0.05)。结论绝经后OP患者血清Smad4和Osterix呈低表达,与患者的骨代谢生化指标和BMD密切相关,且是影响OP发生的独立危险因素,二者联合可以更好地预测患者发生骨折的风险。

肺腺癌组织中FNDC1、Napsin A、Smad4表达及临床意义

目的检测肺腺癌中Ⅲ型纤连蛋白结构域1(FNDC1)、天冬氨酸肽酶A(Napsin A)、Smad4的表达及其临床意义。方法回顾性分析2019年12月至2021年12月华中科技大学同济医学院附属协和医院收治的120例肺腺癌患者临床病例资料,收集患者手术切除肿瘤组织和癌旁正常组织。采用免疫组化染色SP法检测肺腺癌组织与癌旁组织中FNDC1、Napsin A、Smad4表达情况,并分析FNDC1、Napsin A、Smad4表达与肺腺癌临床病理特征的关系。随访患者的生存情况,采用Kaplan-meier法绘制生存曲线,生存差异行Log-rank检验;采用Cox风险比例回归模型分析影响肺腺癌患者预后的因素。结果肺腺癌组织中FNDC1阳性表达率为61.67%,高于癌旁组织的20.0%;Napsin A、Smad4阳性表达率分别为41.67%和65.0%,低于癌旁组织的98.33%和90.83%,差异均有统计学意义(P<0.05)。FNDC1、Napsin A、Smad4表达与性别、年龄无关(P>0.05),与TNM分期、病理学分级、肿瘤最大直径、淋巴结转移均有关(P<0.05)。FNDC1阴性表达组患者中位生存时间(OS)为34个月,优于阳性表达组的27个月;Napsin A、Smad4阳性表达组患者中位生存时间分别为30个月和30个月,优于阴性表达组的27个月和25个月;差异均有统计学意义(P<0.05)。单因素Cox风险比例回归模型显示,TNM分期、肿瘤最大直径、淋巴结转移、FNDC1表达、NapsinA表达、Smad4表达是影响肺腺癌OS的因素(P<0.05)。结论肺腺癌组织中FNDC1表达升高,Napsin A、Smad4表达降低,且FNDC1、Napsin A、Smad4表达与临床病理特征、总生存均有关。

miR-1273g-3p调控TGF-β/Smad4信号通路影响结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨miR-1273g-3p调控转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)/mothers against decapentaplegic homolog 4(Smad4)信号通路对结直肠癌细胞生物学功能的影响。方法 采用人结肠上皮细胞株NCM460为对照,对人结直肠癌细胞株HCT116和SW480采用qRT-PCR检测细胞的miR-1273g-3p表达。采用Western blot检测TGF-β和Smad4蛋白的表达。将miR-1273g-3p抑制剂转染至HCT116和SW480细胞中(miR-1273g-3p抑制剂组),并设立转染抑制剂对照剂的空载对照(抑制剂对照组)。采用qRT-PCR验证转染效果。将转染后的HCT116细胞皮下注射至BALB/c裸鼠体内。采用qRT-PCR和Western blot检测转染后细胞中TGF-β和Smad4 mRNA和蛋白的表达。采用细胞增殖和细胞毒性分析(Cell Counting Kit-8,CCK-8)、划痕实验和transwell小室侵袭实验检测细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过BiBiServ及TargetScan网站预测mi R-1273g-3p与TGF-β的相关性,并用双荧光素酶报告基因实验验证miR-1273g-3p与TGF-β的结合情况。结果 与人结肠上皮细胞NCM460比较,人结直肠癌细胞HCT116和SW480中miR-1273g-3p、TGF-β蛋白和Smad4蛋白均高表达(均P<0.01)。瞬时转染48 h后,与抑制剂对照组比较,miR-1273g-3p抑制剂组miR-1273g-3p表达降低(P<0.01),TGF-β和Smad4的mRNA和蛋白表达均减少(均P<0.01),细胞的增殖、迁移和侵袭能力均降低(均P<0.01)。双荧光素酶报告基因实验结果表明,miR-1273g-3p可以靶向结合TGF-β;SW480细胞中,miR-1273g-3p抑制野生型TGF-β-3’ untranslated region(UTR)质粒转染的荧光素酶活性(P<0.01),而对突变型TGF-β-3’UTR质粒转染的荧光素酶活性无影响(P>0.05)。结论 抑制miR-1273g-3p的表达可抑制结直肠癌细胞HCT116和SW480的增殖、迁移和侵袭能力。此作用可能与TGF-β/Smad4信号通路有关。

麦粒灸对神经根型颈椎病大鼠脊髓及神经根Activin A/ActRⅠ/Smad4表达的影响

目的:通过观察麦粒灸“大椎”穴对神经根型颈椎病大鼠激活素A(Act A)、ActⅠ型受体(ActRⅠ)及受体后信号传导蛋白Smad4表达的影响,探讨麦粒灸治疗神经根型颈椎病(CSR)的镇痛机制。方法:将30只SPF级雌雄各半SD大鼠随机分为空白组、模型组、麦粒灸组,每组10只。采用椎管插线法制备CSR模型。模型组及麦粒灸组均于造模后待伤口恢复7 d,第8天开始干预。空白组正常喂养且不做任何干预措施,模型组仅予腹腔注射1 ml的0.9%氯化钠溶液,麦粒灸组在模型组基础上予麦粒灸“大椎”穴,6壮/次,1次/d。连续干预7 d后,观察各组大鼠步态评分,测量机械痛阈值,采用蛋白免疫印迹检测脊髓及神经根组织Act A、ActRⅠ及Smad4的蛋白。PCR检测脊髓及神经根组织Act A和ActRⅠ的mRNA表达水平,苏木素-伊红染色观察脊髓及神经根组织的形态结构,免疫荧光染色观察Smad4阳性表达水平。结果:与空白组比较,模型组、麦粒灸组大鼠步态评分升高、机械痛阈降低(P<0.05)。与模型组比较,麦粒灸组大鼠脊髓及神经根组织Act A、ActRⅠ及其mRNA表达水平均升高(P<0.05)。Western blotting和免疫荧光结果均显示Smad4表达增加;HE染色观察麦粒灸组脊髓形态损伤较模型组有所减轻,灰质区神经元固缩,尼氏小体减少,神经胶质细胞和毛细血管数量比模型组减少。结论:麦粒灸“大椎”穴能改善CSR大鼠疼痛阈值和运动功能,促进神经元损伤后修复,这与激活Activin A/ActRⅠ/Smad4信号通路有关。

基于BMP2/Smad4信号通路探究蛇床子素对骨质疏松性骨折大鼠愈合过程的影响

目的基于骨形态发生蛋白(BMP)2/Smad4信号通路探究蛇床子素对骨质疏松性骨折(OPF)大鼠愈合过程的影响。方法将90只SD大鼠分成Sham组、OPF组、低剂量组(10 mg/kg蛇床子素)、高剂量组(20 mg/kg蛇床子素)、高剂量+NC组(2μl shRNA)、高剂量+shRNA-BMP2组(2μl shRNA-BMP2),15只/组;摘除大鼠的双侧卵巢以构建骨质疏松(OP)模型,在此模型基础上进行右侧股骨干骨折建立OPF大鼠模型,术后除Sham组及OPF组外其余组灌胃相应剂量蛇床子素,而Sham组及OPF组给予等量生理盐水灌胃,高剂量+NC组、高剂量+shRNA-BMP2组在灌胃第1天于尾静脉注射相应慢病毒,其余组则注射等量生理盐水,灌胃8 w(1次/d);使用双能X线BMD仪检测骨痂部位骨密度(BMD);酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)和碱性磷酸酶(ALP)水平;三点弯曲实验进行股骨生物力学性能检测;Micro-CT扫描股骨骨痂;HE染色观察骨痂组织形态;Western印迹检测骨痂组织成骨细胞特异性转录因子(Osterix)、Runt相关转录因子2(RUNX2)及BMP2/Smad4通路蛋白表达。结果与Sham组比较,OPF组股骨骨痂BMD、ALP水平、RUNX2、Osterix、BMP2、Smad4表达显著降低,股骨刚度及最大载荷、骨体积分数(BV/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)显著减小,TRACP水平显著升高,骨小梁分离度(Tb.Sp)显著增大(均P<0.05);与OPF组比较,低、高剂量组BMD、ALP水平、RUNX2、Osterix、BMP2、Smad4表达显著升高,股骨刚度及最大载荷、BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著增加,TRACP水平显著降低,Tb.Sp显著减小(均P<0.05);与高剂量组比较,高剂量+shRNA-BMP2组BMD、ALP水平、RUNX2、Osterix、BMP2、Smad4表达显著降低,股骨刚度及最大载荷、BV/TV、Tb.Th、Tb.N显著减小,TRACP水平显著升高,Tb.Sp显著增大(均P<0.05)。结论蛇床子素通过激活BMP2/Smad4信号通路来促进OPF大鼠的骨折处愈合。

异氟醚通过BMP4/Smad信号通路对自发性高血压大鼠脑损伤的作用机制研究

目的:探究异氟醚通过调节骨发生形态蛋白4(BMP4)及其下游Smad蛋白对自发性高血压大鼠(SHR)脑损伤的作用机制。方法:采用随机数字表法将48只SHR分为模型组、异氟醚组、阳性药物组、异氟醚+LDN193189组,健康大鼠作为健康对照组,每组12只。各组大鼠分别放入氧气箱中,健康对照组、模型组、阳性药物组大鼠通入特殊气体(30%O_(2)、70%N_(2))1 h,异氟醚组、异氟醚+LDN193189组通入混杂2%异氟醚的特殊气体1 h,通过麻醉气体检测仪检测异氟醚含量,确保异氟醚浓度始终保持在2%。通气结束后,异氟醚+LDN193189组大鼠腹腔内注射BMP4/Smad通路抑制剂溶液20μL(LDN193189,5 mg/kg),阳性药物组大鼠腹腔内注射缬沙坦溶液20μL(10 mg/kg),健康对照组、模型组、异氟醚组大鼠腹腔内注射等量的生理盐水。氧气箱通气实验及注射每日1次,持续10 d。无创血压检测仪检测尾动脉收缩压变化;神经学行为评分评价行为功能;脑含水量检测脑水肿程度;原位末端转移酶标记法(TUNEL)染色和尼氏染色观察海马组织病理学变化及神经元损伤情况;荧光定量聚合酶链式反应(PCR)及蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测海马组织BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表达水平。结果:与模型组比较,异氟醚组、阳性药物组、异氟醚+LDN193189组大鼠海马神经细胞凋亡减少,尼氏小体增多,血压、神经学评分、脑组织含水量显著降低,BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表达量显著升高(P<0.05);与异氟醚组比较,异氟醚+LDN193189组大鼠神经细胞凋亡增多,尼氏小体急剧减少,血压、神经学评分、脑组织含水量显著升高,BMP4、Smad2 mRNA及蛋白表达量显著降低(P<0.05);异氟醚组与阳性药物组各项数据差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:异氟醚可通过促进BMP4/Smad信号通路减轻SHR脑损伤。

Smad4慢病毒转染对万古霉素诱导的肾小管上皮细胞EMT的影响

目的:探究慢病毒介导过表达Smad4或沉默Smad4对万古霉素诱导的肾小管上皮细胞HK-2上皮间质转化(EMT)的影响。方法:设计并包装Smad4沉默或过表达的慢病毒,之后利用所获得的慢病毒瞬时转染HK-2,将HK-2细胞分为万古霉素组、空载体组(转染HBLV-GFP-PURO)、过表达Smad4组(转染HBLV-h-Smad4-GFP-PURO)、沉默Smad4组(转染HBLV-h-Smad4-shRNA-GFP-PURO),另取正常HK-2细胞作为对照组。比较五组细胞迁移能力、上清液中氧化应激指标(TGF-β_(1)、SOD、GSH、MDA)及Smad4、E-cadherin、FN、Vimentin蛋白表达水平。结果:与对照组相比,万古霉素组和空载体组HK-2细胞迁移能力、上清液TGF-β_(1)和MDA含量、Smad4、FN、Vimentin蛋白表达水平升高(P<0.05),SOD、GSH含量、E-cadherin蛋白表达水平降低(P<0.05)。过表达Smad4可提高HK-2细胞迁移能力和氧化应激反应,促进EMT(P<0.05);沉默Smad4可降低HK-2细胞迁移能力和氧化应激反应,抑制EMT(P<0.05)。结论:Smad4调控万古霉素诱导的HK-2细胞氧化应激反应和EMT。

血清SCC-Ag、HE4、SMAD4水平与宫颈癌放化疗敏感性的相关性分析

目的分析血清鳞状细胞癌相关抗原(SCC-Ag)、人附睾分泌蛋白4(HE4)、SMAD4水平与宫颈癌放化疗敏感性的相关性。方法选取接受放化疗治疗的宫颈癌患者74例为研究对象,根据放化疗敏感性分为抵抗组和敏感组,分别有48例和26例。检测患者治疗前后血清SCC-Ag、HE4及SMAD4 mRNA水平,分析治疗前血清SCC-Ag、HE4、SMAD4水平与超声参数的相关性。绘制受试者工作特征曲线(ROC)描述治疗前SCC-Ag、HE4及SMAD4 mRNA水平对放化疗敏感性的预测价值。结果治疗后2组患者血清SCC-Ag、HE4水平较治疗前降低,SMAD4 mRNA水平较治疗前升高(P<0.05);且敏感组患者治疗前、后SCC-Ag、HE4水平均低于抵抗组,SMAD4 mRNA水平均高于抵抗组(P<0.05)。治疗前血清SCC-Ag、HE4与VI呈正相关(γ=0.518、0.544,P<0.05),SMAD4 mRNA与VI呈负相关(γ=-0.581,P<0.05)。ROC曲线显示,治疗前SCC-Ag、HE4及SMAD4 mRNA联合对放化疗敏感性的预测价值较高,AUC为0.863(95%CI:0.764~0.962)。结论血清SCC-Ag、HE4及SMAD4 mRNA水平与宫颈癌放化疗敏感性密切相关,且三者联合对放化疗敏感性具有较高的预测价值。

SMAD2、SMAD3和SMAD4基因在小尾寒羊卵巢活动中的功能分析

为探究SMAD基因家族重要成员SMAD2、SMAD3和SMAD4基因在小尾寒羊繁殖活动中的生物学功能,利用生物信息学技术对SMAD2、SMAD3和SMAD4基因的蛋白理化性质、亲疏水性和亚细胞定位进行分析,并对其二级结构、蛋白互作进行预测及GO(gene ontology)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)的富集分析;然后以小尾寒羊为研究对象,通过免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)确定SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白在卵巢组织中的表达,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)和蛋白免疫印迹(western blot,WB)方法测定SMAD2、SMAD3和SMAD4基因mRNA及其编码蛋白在不同生理阶段卵巢组织和不同直径卵泡中表达水平。结果显示,SMAD2、SMAD3和SMAD4蛋白为亲水性蛋白,理论等电点分别为6.67、6.73和6.50,在不同生理阶段卵巢组织中的阳性表达主要位于卵母细胞、卵泡膜细胞和颗粒细胞,且二级结构中α螺旋和无规则卷曲的占比较高,其蛋白与FOXH1、ACVR1B、SMAD1、TGFβR1、TGFβR2、ZFYVE9、SKI、SKIL、TGIF1和ENSOARP0000001869蛋白存在互作关系。SMAD2、SMAD3和SMAD4基因在TGF-β受体信号通路、TGF-β受体结合、TGF-β激活受体活性中发挥生物学功能,且在TGF-β信号通路富集。SMAD2和SMAD4蛋白在撤栓后42 h卵巢组织中的表达量显著高于撤栓后18 h,其mRNA表达趋势及其编码蛋白表达趋势总体一致;而SMAD3基因mRNA及其编码蛋白的表达量在不同生理阶段卵巢组织中差异不显著。SMAD3基因mRNA及其编码蛋白在中卵泡中的表达量显著高于大卵泡;SMAD2和SMAD4基因表达量在不同直径卵泡中差异不显著。综上所述,SMAD2、SMAD3和SMAD4基因在小尾寒羊卵巢周期性活动中的生物学功能存在差异,SMAD2和SMAD4基因参与小尾寒羊发情初期至排卵前的卵巢生理变化,但不参与卵泡发育;而SMAD3参与卵泡发育。以上研究结果为进一步探索SMAD基因家族在小尾寒羊卵巢活动中的分子机理提供理论参考。