Smad泛素化调节因子2在转化生长因子β1诱导人肺成纤维细胞活化中的作用及其分子机制

目的:观察Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导人肺成纤维细胞活化中的作用,并探讨其可能的分子机制。方法:体外培养人胚肺成纤维细胞MRC-5,10μg·L-1 TGF-β1作用1、2和6h(分别为TGF-β1 1h组、TGF-β1 2h组和TGF-β1 6h组),并设对照组(不加TGF-β1),RT-PCR和Western blotting法分别检测各组细胞中Smurf1和Smurf2mRNA和蛋白的表达水平。MRC-5细胞随机分为对照组(未加入TGF-β1或siRNA)、TGF-β1组(10μg·L-1 TGF-β1)、Control siRNA转染组(10μg·L-1 TGF-β1+Control siRNA)和Smurf2siRNA转染组(10μg·L-1 TGF-β1+Smurf2siRNA)。Western blotting法检测各组细胞中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和Ⅰ型胶原α1(COL1A1)的表达水平;RT-PCR和Western blotting法分别检测各组细胞中Smad7、核转录共抑制因子SnoN、TGF-βⅠ型受体(TβRⅠ)、Smad2和Smad3mRNA和蛋白的表达水平。结果:与对照组比较,各TGF-β1组细胞中Smurf2 mRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),且随着TGF-β1作用时间的延长,其表达水平呈逐渐增加的趋势;与对照组比较,各TGF-β1组细胞中Smurf1表达水平无明显变化(P>0.05)。与TGF-β1组比较,Smurf2siRNA组细胞中Smurf2蛋白表达水平下降(P<0.05)。与对照组比较,TGF-β1组细胞中α-SMA和COL1A1蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与TGF-β1组比较,Smurf2siRNA组细胞中α-SMA和COL1A1蛋白表达水平均下降(P<0.05)。与对照组比较,TGF-β1组和Smurf2siRNA组细胞中Smad7和SnoN mRNA表达水平均升高(P<0.05),而Smurf2siRNA组和TGF-β1组细胞中Smad7和SnoN mRNA表达水平无明显变化(P>0.05)。与对照组比较,TGF-β1组细胞中Smad7和SnoN蛋白表达水平均明显下降(P<0.05);与TGF-β1组比较,Smurf2siRNA组细胞中Smad7和SnoN蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。与对照组比较,TGF-β1组和Smurf2siRNA组细胞中TβRⅠmRNA和蛋白表达水平均明显升高(P<0.05),而Smurf2siRNA组和TGF-β1组细胞中TβRⅠmRNA和蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。各组细胞中Smad2和Smad3mRNA和蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:Smurf2可能通过泛素化降解Smad7和SnoN,参与调控TGF-β1/Smads信号通路,从而发挥其促进TGF-β1活化肺成纤维细胞的作用。

Smad泛素化调节因子2siRNA的筛选及转染原代肾小管上皮细胞条件的优化

试验旨在优化Smad泛素化调节因子2（Smurf2） siRNA最佳转染条件，筛选最佳siRNA干扰片段，进而实现对Smurf2基因的瞬时沉默，为研究Smurf2基因在马兜铃酸肾病（aristolochic acid nephrohathy，AAN）中的作用奠定基础。本研究通过培养小鼠原代肾小管上皮细胞（renal tubular epithelial cells，RTECs），并以脂质体LipofectamineTM 2000为转染介质，将Smurf2 siRNA转染入RTECs；通过观察绿色荧光的表达量及Real-time PCR反应优化转染条件，转染后Real-time PCR检测mRNA表达抑制率。CCK-8法检测Smurf2 siRNA复合物对RTECs活性的影响；同时，用Real-time PCR和Western blotting检测不同位点Smurf2 siRNA对Smurf2 表达的影响。结果显示,当Lipofectamine TM 2000与siRNA比例为1.5 μL∶30 pmol时，转染效率最高，为70%～80%；Smurf2-619 siRNA干扰效果最明显；与正常组相比，转染siRNA组的Smurf2蛋白表达水平显著下降（P〈0.05）。最终确定了Smurf2 siRNA最佳转染条件，其中Smurf2-619 siRNA对Smurf2 表达的抑制率最高。

Smad泛素化调节因子2对人胚胎眼巩膜成纤维细胞TGF-β1/Smads信号通路和I型胶原表达的影响

目的探讨Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导后对人胚胎眼巩膜成纤维细胞(HFSFs)分泌Smads蛋白、I型胶原α1(COLIA1)的影响,探讨泛素化在巩膜重塑中的作用。方法HFSFs复苏并稳定传代后,免疫组化(IHC)法检测细胞中Smurf2的表达。将HFSFs细胞分别设空白对照组、TGF-β1组(加入10 ng/mL TGF-β1)、Control siRNA转染组(10 ng/mL TGF-β1+Control siRNA)及Smurf2 siRNA转染组(10ng/mL TGF-β1+Smurf2 siRNA)。Western Blot法检测COLIA1蛋白表达水平。RT-PCR法检测各组细胞中Smurf2、Smad2、Smad3和Smad7的mRNA表达水平。结果IHC结果显示,HFSFs中有Smurf2蛋白表达。TGF-β1诱导HFSFs中COLIA1蛋白显著性高表达,而当Smurf2被抑制时,COLIA1蛋白表达受抑制。与空白对照组比较,Smad7 mRNA表达水平呈上升趋势,差异有统计意义(P<0.05),但Smad7蛋白表达水平与PCR结果不完全相同;各培养组中Smad2和Smad3 mRNA和蛋白表达水平,与对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论Smurf2表达于HFSFs细胞中,且随着Smurf2表达减少,HFSFs细胞中Smad7蛋白含量呈上升趋势,COLIA1含量呈下降趋势。提示Smurf2可能通过作用于TGF-β1/Smads信号通路参与了巩膜重塑过程。

Research status of E3 ubiquitin ligase Smurf2 and related signaling pathways in glioma

Glioma is the tumor with the highest incidence in the brain,and it is eager to seek new and efiective treatment.The interaction of ubiquitination and deubiquitination regulates many cell activities in organisms,and participates in tumor occurrence,development,migration,invasion and other processes.This article summarized the progress of E3 ubiquitination ligase smad ubiquitination regulatory factor 2(Smurf2)and glioma-related signaling pathways to assist clinical diagnosis and treatment of glioma.

补肾中药对肾虚骨质疏松症大鼠肾组织中Smurf2的mRNA和蛋白表达影响研究

目的:通过研究摘除卵巢致肾虚骨质疏松症大鼠肾组织中Smurf2的mRNA和蛋白的表达,揭示摘除卵巢致肾虚骨质疏松症的病理机制,并研究补肾中药防治疗效及其作用机制。方法:摘除雌性大鼠双侧卵巢的方法复制肾虚骨质疏松症模型,采用具有补肾壮骨益精作用的补肾中药(高、低剂量)对实验大鼠治疗12周,以骨疏康颗粒剂、盖天力片作为阳性对照组,正常大鼠、假手术组作为标准对照组,模型大鼠作为空白对照组,并与补脾中药作疗效的比较。用RT-PCR法、Western印迹法检测肾虚骨质疏松症大鼠肾组织中Smurf2的mRNA和蛋白表达。结果:RT-PCR及Western方法检测,正常大鼠肾组织中存在Smurf2的mRNA和蛋白表达;与正常组、假手术组比较,模空组Smurf2 mRNA和蛋白的表达水平在肾组织中明显降低。用药12周后,与模空组比较,补肾高、低剂量组、盖天力组可明显上调Smurf2 mRNA和蛋白在肾组织中的表达水平。其中补肾高剂量组上调幅度大于补肾低剂量组。结论:①正常大鼠肾组织中Smurf2可以在基因、蛋白水平表达;②骨质疏松症的发生,可能与肾组织中Smurf2的mRNA和蛋白表达的异常变化有关;③补肾中药通过调控肾组织中Smurf2的mRNA和蛋白表达,对于骨质疏松症有一定的防治作用。

糖尿病大鼠肾组织Smurf2表达及其与SnoN蛋白降解的关系

目的:观察Smad泛素化调节因子2(Smurf2)和核转录共抑制因子SnoN在糖尿病(DM)大鼠肾组织的动态表达,并初步探讨Smurf2在DM大鼠肾组织SnoN蛋白表达变化中的作用。方法:链脲佐菌素(STZ)尾静脉注射复制DM大鼠模型,随机分为DM2、4、8、12、16和24周组,每组均设鼠龄匹配的正常对照组(n=6)。生化方法测血糖、血肌酐(Scr)及24h尿蛋白量,计算肾脏指数;HE染色观察胰腺和肾组织病理学改变;免疫荧光染色检测胰腺组织胰岛素、肾组织Smurf2和SnoN的表达;Westernblotting检测肾皮质Smurf2、SnoN、转化生长因子β1(TGF-β1)和磷酸化Smad2(p-Smad2)蛋白的表达;RT-PCR检测肾皮质Smurf2和SnoN的mRNA。结果:(1)DM各组血糖、血Scr、24h尿蛋白量和肾脏指数均高于正常对照组,正常胰腺组织胰岛素表达强,DM大鼠胰岛素表达则明显减弱;(2)Smurf2和SnoN蛋白均主要表达于肾小管上皮细胞,从DM2周始各DM组Smurf2、TGF-β1和p-Smad2蛋白表达均多于正常对照组,DM4周起各DM组SnoN蛋白均少于正常对照组,DM各组SnoNmRNA与正常组相比无显著差异,Smurf2mRNA随病程进展逐渐增多;(3)Smurf2和SnoN蛋白的表达量呈显著负相关(r=-0.88,P<0.01)。结论:在糖尿病肾病发病过程中SnoN蛋白的表达减少可能与Smurf2介导其泛素化降解有关。

MG132对高糖条件下肾小管上皮细胞SnoN蛋白表达及纤维化效应的影响

目的:观察蛋白酶体抑制剂MG132对高糖培养条件下肾小管上皮细胞核转录共抑制因子Sno N蛋白表达的影响,探讨MG132减轻高糖状态下肾小管纤维化病变的作用及可能机制。方法:将体外培养的NRK-52E细胞分为正常组(NG)、高糖组(HG)和不同浓度MG132预处理后高糖培养组(HG+MG132),采用免疫荧光双染的方法观察E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在肾小管上皮细胞中的表达和分布,用Western blotting方法检测Sno N、Samd泛素化调节因子2(Smurf2)、Arkadia、E-cadherin、α-SMA和Ⅰ型胶原(Col-Ⅰ)等目标蛋白的相对表达量。结果:与NG组相比,HG组肾小管上皮细胞E-cadherin和Sno N表达减少(P<0.05),而α-SMA、Col-Ⅰ、Smurf2和Arkadia表达增多(P<0.05);与HG组相比,不同浓度MG132预处理肾小管上皮细胞后高糖培养,可见肾小管上皮细胞中Sno N和E-cadherin蛋白表达显著上调(P<0.05),而α-SMA和Col-Ⅰ蛋白的表达显著下调(P<0.05),并且这种效应呈量效依赖性,但MG132预处理对Smurf2和Arkadia的表达无影响。结论:MG132可对抗高糖介导的肾小管上皮细胞的纤维化效应,其机制可能是通过减少Sno N蛋白的泛素化降解作用实现的。

骨肉瘤与骨良性病变组织中Smurf1、BMP-2的表达及相关性分析

目的:研究Smad泛素化调节因子1(Smad ubiquitin regulatory factor-1,Smurf1)与骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)在骨的良性病变及骨肉瘤组织中的表达及相关性,以此分析Smurf1蛋白在骨肉瘤的发生、侵袭、转移中的意义。方法:共收集骨组织标本120例,其中良性病变36例,骨肉瘤84例。免疫组化法检测标本中Smurf1和BMP-2含量,相关性分析采用Spearman等级相关分析法。结果:骨肉瘤组织Smurf1蛋白阳性表达明显高于良性病变组织[(0.786±0.214)vs.(0.583±0.183)],BMP-2蛋白表达水平则相反[(103.57±13.23)vs.(152.19±19.42)],差异均有统计学意义(P<0.05)。Smurf1与BMP-2在骨肉瘤组织中的蛋白表达水平呈显著负相关(r=-0.598,P<0.05)。结论:Smurf1可通过抑制BMP-2的表达来促进骨肉瘤的形成和发展。

Smurf1拮抗BMP-2对C2C12细胞的诱导成骨作用

目的研究Smad泛素化调节因子1(Smurf1)对基因重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)诱导成骨作用的影响。方法通过将质粒pcDEF3-Smurf1临时转染C2C12细胞并应用实时PCR和Western免疫印迹法鉴定其表达Smurf1,空载体pcDNA3.1作为阴性对照;然后用比色法测定细胞碱性磷酸酶活性和实时PCR分析细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达,观察Smurf1对rhBMP-2诱导C2C12细胞向成骨细胞分化的影响。同时在相差显微镜下观察细胞形态的变化。结果Smurf1在C2C12细胞可以通过临时转染获得很好的表达。尽管在细胞形态上没有明显的差别,但Smurf1转染的C2C12细胞在rhBMP-2作用48 h后,细胞碱性磷酸酶活性以及细胞碱性磷酸酶、骨钙素、成骨转录因子Osterix基因表达均较对照组明显下降。结论Smurf1在BMP诱导成骨过程中发挥着负性调节作用。

Smurf2与肺纤维化关系研究进展

Smad泛素化调节因子2(Smurf2)是E3泛素连接酶的一种。研究发现,Smurf2与肺纤维化的发生发展有一定关系,其可选择性作用于Smad蛋白,调节肺纤维化TGF-β1信号传导,进而调控肺纤维化的发展。本文主要就Smurf2与肺纤维化TGF-β1/Smad信号通路的关系研究进展做一综述。

泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达

本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mR-NA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。

DPC4和Smurf2在子宫内膜腺癌中的表达及临床意义

目的检测胰腺癌缺失基因(DPC4)及Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在增殖期子宫内膜、子宫内膜不典型增生及子宫内膜腺癌组织中的表达,探讨两者与子宫内膜腺癌发生发展的关系。方法采用免疫组化SP法检测DPC4和Smurf2在上述3种组织中的表达情况,并结合年龄、病理分期、组织学分级、肌层浸润深度及淋巴结转移等临床特征进行相关性分析。结果与增殖期子宫内膜表达相比在子宫内膜腺癌中,DPC4呈低表达,而Smurf2呈高表达(均P<0.05),两者呈负相关(r=-0.525,P<0.05),两因子在子宫内膜腺癌中的表达均与其病理分级和临床分期相关(均P<0.05),而与淋巴结转移、癌肿浸润肌层深度及年龄无关(均P>0.05)。结论DPC4和Smurf2均与子宫内膜腺癌的发生发展相关,两者均与其病理分级和临床分期有关,而与淋巴结转移及癌肿浸润肌层深度无关,可作为肿瘤恶性程度及预后指标。

扶肾方调节各种细胞因子干预腹膜间皮细胞EMT的实验研究

目的探讨扶肾方对大鼠腹膜间皮细胞转化生长因子-β受体Ⅰ(TGF-βRⅠ)、TGF-βRⅡ、Smad泛素化相关因子2(Smurf2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)的影响及抑制上皮-间充质转分化(EMT)的作用机制。方法原代培养大鼠腹膜间皮细胞,传至第2代并鉴定后,分为空白对照(C)组,含药血清(B)组,模型(T)组(40μg/L TGF-β1),模型+含药血清(T+B)组,模型+MG132(T+M)组。培养24 h后收集细胞和培养液上清液,采用蛋白印迹法检测Smurf2蛋白水平,qPCR检测各组TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、E-cadherin、ZO-1的m RNA转录水平。结果与C组比较,T组E-cadherin、ZO-1、TGF-β1RⅡmRNA、Smurf2蛋白表达明显上调(P<0.05);与T组比较,B组E-cadherin、ZO-1 mRNA表达均上调,T+B组E-cadherin、ZO-1、TGF-β1RⅡmRNA表达均上调,Smurf2蛋白表达下调,T+M组E-cadherin、ZO-1、TGF-β1RⅠmRNA、Smurf2蛋白表达均下调,TGF-β1RⅡm RNA表达上调(P<0.05);与B组比较,T+B组和T+M组E-cadherin mRNA表达下调,T+M组ZO-1、TGF-β1RⅠm RNA表达下调(P<0.05);与T+B组比较,T+M组E-cadherin、ZO-1、TGF-β1R,TGF-β1RⅡmRNA表达均下调(P<0.05)。结论扶肾方抑制大鼠腹膜间皮细胞EMT可能与上调TGF-βRⅡmRNA转录,下调Smurf2蛋白含量,促进E-cadherin、ZO-1 mRNA的转录相关。

Smad泛素化调节因子2在肝纤维化过程中对结缔组织生长因子的作用研究

目的:在体内和体外研究Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在肝纤维化过程中对结缔组织生长因子(CTGF)的作用。方法:建立四氯化碳诱导肝纤维化大鼠模型,收集人类肝硬化和正常肝组织样本,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹(Western blot,WB)、免疫组织化学(IHC)方法检测Smurf2和CTGF的表达;培养人类肝星状细胞(LX-2),构建Smurf2表达质粒和小干扰RNA(siRNA),在转化生长因子β1(TGF-β1)作用后,通过WB检测Smurf2过表达和小干扰后对CTGF表达的影响。结果:在大鼠肝纤维化时,Smurf2表达增加,伴有CTGF水平增高;大鼠和人类肝硬化组织中,Smurf2表达反而减少,CTGF表达仍然增加。体外肝星状细胞用TGF-β1处理后,CTGF蛋白水平升高;过表达Smurf2可以阻断CTGF蛋白的合成;抑制Smurf2表达后,CTGF表达持续增加。TGF-β1处理LX-2后可以诱导Smurf2表达内源性轻度增加。结论:Smurf2可以由TGF-β1诱导产生,作为负反馈抑制子抑制肝纤维化过程中CTGF表达的增加。

特发性肺纤维化中Smurf2对TGF—β1／Smad通路调控机制

特发性肺纤维化是肺间质纤维化的主要原因，为最常见的间质性肺疾病。其主要病理特点为大量成纤维细胞、肌成纤维细胞集聚、增殖。近年来研究表明转化生长因子B。（transforming growth factor-β1，TGF-β1）在肺纤维化的形成与发展中起关键性作用。Smad蛋白是参与TGF-β1信号细胞内传导的一类信号蛋白，是TGF-β1信号传导重要通路。近年来发现Smad泛素调节因子2（Smad ubiquitination regulatory factor 2，Smurf2）可选择性作用于Smad蛋白，进而调控TGF-β信号传导。本文就特发性肺纤维化中Smurf2对TGF-β1／Smad通路的调控机制作一综述。

转化生长因子β_1对人巩膜成纤维细胞Smad泛素化调节因子2和Ⅰ型胶原α_1影响的研究

目的探讨Smad泛素化调节因子2(Smurf2)在人胚胎眼巩膜成纤维细胞(HFSFs)中的表达,检测转化生长因子β_1(TGF-β_1)影响下HFSFs中Smurf2和Ⅰ型胶原α_1(COLIA1)含量的变化。方法 HFSFs复苏并稳定传代后,用免疫细胞化学法检测细胞中Smurf2的表达。分别用不同浓度的TGF-β_1(0、1 ng/ml、5 ng/ml及10 ng/ml)处理HFSFs 24 h以及10 ng/ml TGF-β_1处理HFSFs不同时长(1 h、6 h、12 h及24 h)后,用实时荧光定量法检测各组Smurf2信使核糖核酸(mRNA)和COLIA1 mRNA表达水平。数据以均数±标准差(±s)描述,不同浓度和不同时长的组间比较采用单因素方差分析,当差异有统计学意义时,进一步采用SNK法两两比较。结果免疫细胞化学检测的结果显示,HFSFs中有COLIA1 mRNA和Smurf2蛋白的表达。与空白对照组比较,TGF-β_110 ng/ml组COLIA1 mRNA的表达呈上升趋势(F=3. 17,P <0. 05),TGF-β_15 ng/ml、10 ng/ml组Smurf2 mRNA表达上调(F=2. 35,2. 00; P <0. 05)。10 ng/ml TGF-β_1干预HFSFs培养1 h、6 h、12 h及24 h后,24 h组COLIA1 mRNA表达显著升高(F=29. 20,P <0. 05)。Smurf2 mRNA表达改变呈先上升后下降趋势,在6 h达到最高(F=10. 65,P <0. 05)。结论 TGF-β_1可能通过调控HFSFs Smurf2的表达,诱导HFSFs COLIA1的合成。

沉默Smad泛素化调节因子2基因对人增生性瘢痕成纤维细胞功能的影响

目的探讨沉默Smad泛素化调节因子2（Smurf2）基因对人增生性瘢痕Fb分泌TGF－β1、α平滑肌肌动蛋白（α－SMA）、Ⅰ型胶原的影响。 方法取9例烧伤后增生性瘢痕患者的正常皮肤组织和瘢痕组织，用组织块法培养人正常皮肤Fb和增生性瘢痕Fb，将2种第3代Fb均按随机数字表法分成6组，每组9孔。空白对照组，不加任何小干扰RNA培养72 h；阴性对照组，转染非靶向的小干扰RNA培养72 h；Smurf2小干扰RNA转染组，转染100 nmol/L的Smurf2小干扰RNA培养72 h；空白对照＋TGF－β1组，不加任何小干扰RNA培养72 h后加入10 ng/mL TGF－β1刺激6 h；阴性对照＋TGF－β1组，转染非靶向的小干扰RNA培养72 h后加入10 ng/mL TGF－β1刺激6 h；Smurf2小干扰RNA转染＋TGF－β1组，转染Smurf2小干扰RNA培养72 h后加入10 ng/mL TGF－β1刺激6 h。（1）分别采用蛋白质印迹法、RT－PCR法检测2种细胞空白对照组、阴性对照组、Smurf2小干扰RNA转染组Smurf2的蛋白和mRNA表达。（2）采用ELISA法检测2种细胞空白对照组和Smurf2小干扰RNA转染组细胞培养上清液中TGF－β1含量。（3）采用蛋白质印迹法检测2种细胞6组α－SMA的蛋白表达，ELISA法检测2种细胞6组细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量。（4）采用RT－PCR法检测2种细胞6组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达。以上实验中各组样本数均为9。对数据行析因设计方差分析、Bonferroni法检验。 结果（1）2种细胞Smurf2小干扰RNA转染组中Smurf2的蛋白和mRNA表达量均明显低于空白对照组和阴性对照组（P值均小于0.05），空白对照组和阴性对照组中Smurf2的蛋白和mRNA表达量均相近（P值均大于0.05）。（2）增生性瘢痕Fb空白对照组和Smurf2小干扰RNA转染组细胞培养上清液中TGF－β1含量分别为（4.34±0.56）、（2.14±0.28）pg/mL，均明显高于正常皮肤Fb的（1.52±0.20）、（1.41±0.18）pg/mL（P值均小于0.05）。增生性瘢痕Fb中，Smurf2小干扰RNA转染组细胞培养上清液中TGF－β1含量明显低于空白对照组（P〈0.05）；正常皮肤Fb中，Smurf2小干扰RNA转染组细胞培养上清液中TGF－β1含量与空白对照组相近（P〉0.05）。（3）2种细胞空白对照＋TGF－β1组α－SMA蛋白表达量和细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量均明显高于空白对照组（P值均小于0.05），阴性对照＋TGF－β1组α－SMA蛋白表达量和细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量均明显高于阴性对照组（P值均小于0.05），Smurf2小干扰RNA转染组α－SMA蛋白表达量和细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量均与空白对照组和阴性对照组相近（P值均大于0.05），Smurf2小干扰RNA转染＋TGF－β1组α－SMA蛋白表达量和细胞培养上清液中Ⅰ型胶原含量均明显低于空白对照＋TGF－β1组和阴性对照＋TGF－β1组（P值均小于0.05）。（4）2种细胞空白对照＋TGF－β1组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达量均明显高于空白对照组（P值均小于0.05），阴性对照＋TGF－β1组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达量均明显高于阴性对照组（P值均小于0.05），Smurf2小干扰RNA转染组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达量均与空白对照组和阴性对照组相近（P值均大于0.05），Smurf2小干扰RNA转染＋TGF－β1组α－SMA和Ⅰ型胶原的mRNA表达量均明显低于空白对照＋TGF－β1组和阴性对照＋TGF－β1组（P值均小于0.05）。 结论沉默人增生性瘢痕Fb中Smurf2基因，可减少TGF－β1的自分泌及抑制TGF－β1诱导的α－SMA表达和Ⅰ型胶原合成。

补肾中药对肾虚骨质疏松症大鼠骨、肾、下丘脑组织中Smurf1/Smurf2的mRNA表达影响

目的:探讨摘除卵巢致肾虚骨质疏松症的病理机制,并研究补肾中药防治疗效及其作用机制。方法:摘除雌性大鼠双侧卵巢的方法复制肾虚骨质疏松症模型,采用具有补肾壮骨益精作用的补肾中药(高、低剂量)对实验大鼠治疗12周,以骨疏康颗粒剂、盖天力片作为阳性对照组,正常大鼠、假手术组作为标准对照组,模型大鼠作为空白对照组。用RT-PCR法检测肾虚骨质疏松症大鼠骨、肾、下丘脑组织中Smurf1/Smurf2的m RNA表达。结果:与模空组相比较,补肾中药高、低剂量组可不同程度上调骨、肾组织中Smurf1/Smurf2的m RNA表达水平(P<0.01),并明显下调在下丘脑组织中Smurf1/Smurf2的m RNA表达水平(P<0.01),其中,补肾中药高剂量组效果最佳(P<0.05,P<0.01)。结论:骨质疏松症的发生,可能与骨、肾、下丘脑组织中Smurf1/Smurf2的m RNA表达的异常变化有关;补肾中药通过调控骨、肾、下丘脑组织中Smurf1/Smurf2的m RNA表达,对于骨质疏松症有一定的防治作用。

IgA肾病大鼠肾Smurf2与TGF-β1表达的关系及其意义

目的明确免疫球蛋白(IgA)肾病大鼠Smad泛素化调节因子2(Smurf2)与转化生长因子β1(TGF-β1)表达的部位、关系,及其对肾脏病变的影响。方法将27只4~6周龄雄性SD大鼠,随机分成3组,分别为正常对照组,轻度系膜增生组及中重度系膜增生组,每组9只,使用牛血清+脂多糖+四氯化碳方法制造IgA肾病模型,并使用原位免疫荧光方法观察Smurf2及TGF-β1蛋白表达部位。使用qRT-PCR方法及蛋白免疫印迹法(Western blot)分别进行Smuf2、TGF-β1 mRNA及蛋白质表达。结果 (1)IgA肾病模型造模成功,中重度系膜增生组系膜增生程度和肾间质基质增生纤维化程度较轻度系膜增生组明显,正常对照组无系膜增生、间质基质增生纤维化改变。IgA肾病组系膜在可见IgA颗粒性沉积,以中重度系膜增生组明显,正常对照组阴性。(2)Smurf2和TGF-β1主要在IgA肾病肾小球表达,其次在肾小管表达,正常对照组偶见表达,二者表达量呈正相关。(3)Smurf2 mRNA和TGF-β1 mRNA在IgA肾病组表达较对照组增加,且在中重度系膜增生组表达最多。结论 IgA肾病Smurf2主要在肾小球表达,与TGF-β1表达部位及趋势相同,随着系膜增生程度加重,表达增多,Smurf2表达可能通过兴奋TGF-β1/Smad信号通路在IgA肾病肾小球硬化及间质纤维化方面起促进作用。

USF2与其截短体真核表达载体的构建及对Smurf1/2转录水平的影响

目的构建上游刺激因子2(USF2)及其截短体的真核表达载体,鉴定USF2蛋白中抑制泛素连接酶Smurf1/2转录的功能区域。方法采用PCR技术扩增USF2及其两个截短体USF2(1~235aa)、USF2(236~346aa)编码基因,分别将其构建在pCMV-Myc重组载体上,转染真核细胞后验证其表达,Western blot及实时定量PCR确定USF2下调Smurf1/2转录水平的区域。结果成功地将USF2及其两个截短体编码基因构建至pCMV-Myc载体,并验证其在真核细胞中的正确表达,Western Blot和实时定量PCR实验结果显示,USF2 C端236~346aa区域对Smurf1/2的转录水平有抑制效应。结论 USF2通过其C端236~346aa区域对Smurf1/2的转录产生抑制效应。