miR-10b靶向TGFBR1/SMAD3通路对特发性矮小症的软骨细胞增殖、肥大的影响机制

目的研究miR-10b对特发性矮小症(ISS)的影响及作用机制。方法收集ISS患儿(ISS组)和体检健康儿童(健康对照组)各54例,qPCR检验血清miR-10b表达量,分析ISS组患儿血清miR-10b表达与患儿临床资料的关系。采用miR-10b inhibitor、si-TGFBR1及各自阴性对照转染C28/I2细胞,利用CCK-8实验检测C28/I2细胞增殖能力,Western blot检测侏儒相关转录因子2(RUNX2)、X型胶原α1链(COL10A1)、转化生长因子β受体1(TGFBR1)、SMAD3、pSMAD3蛋白表达量。在StarBase数据库筛选miR-10b靶点,利用双萤光素酶报告基因实验验证miR-10b与TGFBR1的靶向关系。结果ISS组血清miR-10b表达量高于健康对照组,且miR-10b表达越高,患儿的身高、IGF-1、骨特异性碱性磷酸酶的下降越明显(P<0.05)。与NC组相比,miR-10b inhibitor组细胞增殖能力升高,RUNX2、COL10A1、TGFBR1、pSMAD3蛋白表达上调(P<0.05);StarBase数据库提示miR-10b存在TGFBR1的结合位点,双萤光素酶报告基因实验证实两者结合。与si-NC相比,si-TGFBR1组TGFBR1表达量下调,细胞增殖能力下降(P<0.05)。结论miR-10b通过靶向TGFBR1/SMAD3通路在特发性矮小症中抑制软骨细胞的增殖、肥大。

肾纤康通过调节Smad3介导的铁死亡缓解CKD小鼠肾纤维化

目的:观察肾纤康对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)引起的小鼠肾间质纤维化的缓解效果,并探讨其作用机制。方法:将小鼠随机分为假手术组、模型组、低剂量(150 mg·kg^(−1)·d^(−1))肾纤康组和高剂量(450 mg·kg^(−1)·d^(−1))肾纤康组,每组8只。除假手术组外,其余各组均通过单侧输尿管结扎法建立慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)模型。造模后,分别给予相应剂量的肾纤康,假手术组和模型组则灌胃等体积生理盐水,每天1次,连续7 d。实验结束后,收集小鼠肾脏组织进行苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和Masson染色,观察肾脏组织损伤和纤维化程度;利用免疫组化和Western blot技术检测肾脏中纤维化、氧化应激及铁死亡相关蛋白水平的变化;蛋白质免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)评估肾纤康对转录激活因子3(activating transcription factor 3,ATF3)与Smad3相互作用的影响。结果:在未经治疗的UUO模型组中,小鼠肾脏出现了如肾小管明显扩张和胶原沉积等典型的病理变化,肾纤康干预组病理改变程度和纤维化明显减轻(P<0.05)。在分子层面,肾纤康显著降低了UUO模型组小鼠中Smad3磷酸化水平,以及ATF3、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4-HNE)和NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)的异常表达,同时增加了谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)表达。Co-IP实验结果表明,肾纤康显著影响了ATF3与Smad3的相互作用。结论:肾纤康有效缓解了UUO引起的小鼠肾间质纤维化,其潜在机制可能涉及对ATF3/Smad3相互作用的调节,进而减轻氧化应激和铁死亡,从而缓解肾脏纤维化。这些发现为肾纤康的进一步研究和临床应用提供了重要的科学依据。

NLRP3炎性小体对哮喘小鼠TGF-β1/Smad3信号通路的调控及机制研究

目的观察NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性小体对哮喘小鼠转化生长因子β1(TGF-β1)/Smad3信号通路的调控作用,并探讨其对哮喘气道重塑影响的可能机制。方法将24只雌性BALB/c小鼠随机分成正常对照组(NC组,n=8)、哮喘组(AS组,n=8)、哮喘组+MCC950干预组(AS+MCC950干预组,n=8)。AS组和AS+MCC950干预组通过给予鸡卵清白蛋白致敏和雾化吸入激发,制作哮喘小鼠模型,AS+MCC950干预组予NLRP3特异性抑制剂MCC950(10 mg/kg)进行干预。采用HE和AB-PAS染色观察各组小鼠肺组织的病理形态,qRT-PCR检测肺组织中NLRP3 mRNA表达,IHC染色检测肺组织NLRP3、TGF-β1和Smad3蛋白表达,Western blot检测肺组织中NLRP3蛋白表达,ELISA法检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子IL-1β和IL-18水平。结果与NC组比较,AS组小鼠BALF中IL-1β和IL-18表达、气道上皮杯状细胞和黏液分泌、肺组织中NLRP3、TGF-β1、Smad3蛋白表达和NLRP3 mRNA表达水平均升高(P<0.05),使用MCC950干预后,AS+MCC950干预组小鼠上述指标的表达水平较AS组下降(P<0.05)。结论MCC950可以特异性的抑制NLRP3炎性小体的活化,下调炎症因子IL-1β和IL-18分泌,抑制肺组织中TGF-β1和Smad3的表达,其可能机制是通过干预NLRP3/IL-1β/TGF-β1/Smad3信号通路来抑制哮喘小鼠气道重塑,说明NLRP3炎性小体参与调控哮喘小鼠TGF-β1/Smad3信号通路。

跨种属研究Smad3在肝癌组织中的表达及意义

目的:研究Smad3在人、大鼠、树鼩等不同种属的肝癌、癌旁及正常肝组织中的表达和意义,进一步验证跨种属筛选肝癌关键蛋白研究策略的可行性。方法:采用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测人、大鼠和树鼩的肝癌及其相应癌旁组织以及正常肝组织中Smad3 mRNA和蛋白表达水平。结果:Smad3 mRNA在人、大鼠和树鼩的肝癌中表达水平均低于其相应的癌旁组织(均P<0.05);在大鼠肝癌组织中的表达低于正常肝组织(P<0.05);在树鼩癌旁组织中的表达高于正常肝组织(P<0.05);其余各组织间mRNA表达水平的差别无统计学意义(均P>0.05)。Smad3蛋白在人和大鼠的肝癌组织中的表达水平均低于其相应的癌旁组织及正常肝组织(均P<0.05);在树鼩肝癌组织中的表达水平也低于相应的癌旁组织和正常肝组织,但差别无统计学意义(均P>0.05);3个种属的癌旁组织与正常肝组织比较,差别无统计学意义(均P>0.05)。结论:Smad3在人、大鼠和树鼩3个种属的肝癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均下调,提示该蛋白表达水平的改变可能在肝癌发生发展中起重要作用,有可能成为防治肝癌的靶分子。

非小细胞肺癌中Twist通过TGF-β/Smad3信号通路促进EMT的发生

目的:探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织转录因子Twist调控TGF-β/Smad3的表达,促进上皮间质转化(EMT)的发生机制。方法:采用免疫组织化学法检测NSCLC组织样本中Twist、TGF-β/Smad3以及EMT中代表性分子E-cadherin和Vimentin蛋白表达,并统计分析二者表达之间的相关性。结果:Twist、Smad3、Vimentin蛋白阳性着色定位于细胞质和细胞核内,Ecadherin蛋白阳性着色定位于细胞膜。Twist、Smad3、E-cadherin、Vimentin蛋白在NSCLC中阳性率分别为72.3%(120/166)、71.1%(118/166)、54.2%(90/166)、69.9%(116/166),显著高于癌旁组织,差异有统计学意义。Twist与Smad3、Smad3与E-cadherin、Vimentin在NSCLC不同分化程度及不同TNM分期均呈显著相关。结论:NSCLC中Twist可能通过TGF-β/Smad3信号通路促进EMT的发生。

黄芪注射液对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤中Smad3、Smad7表达的影响

目的探讨黄芪注射液对SD大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)中Smad3、Smad7表达的影响和机制。方法采用结扎左冠状动脉的方法制备心肌缺血再灌注损伤动物模型。32只健康成年SD大鼠,体质量(230±20)g,平均分为假手术组、缺血再灌注组、辛伐他汀组和黄芪预处理组。通过免疫组织化学和RT-PCR,分别测定Smad3蛋白、Smad7蛋白及Smad3mRNA、Smad7mRNA的表达。计算各组中心肌细胞的凋亡率。结果与假手术组相比,缺血再灌注组心肌细胞的凋亡率明显增加(P=0.000),并且Smad3蛋白和Smad3mRNA表达增加(P=0.000),Smad7蛋白和Smad7mRNA表达减少(P=0.000);与缺血再灌注组相比,黄芪注射液组(P=0.000)和辛伐他汀组(P=0.000)可明显降低心肌细胞的凋亡率;Smad3蛋白和Smad3mRNA表达减少(P=0.000);而Smad7蛋白和Smad7mRNA表达增加(P=0.000)。结论黄芪注射液可以上调SD大鼠缺血再灌注损伤时心肌细胞Smad7蛋白和Smad7mRNA表达,下调Smad3蛋白和Smad3mRNA表达。

转化生长因子-β1对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖及Smad3、Smad7表达的影响

目的:观察转化生长因子(TGF)-β1对绒毛膜癌JEG-3细胞增殖能力及其Smad3、Smad7蛋白表达的影响。方法:体外培养人绒毛膜癌JEG-3细胞,分别给予不同剂量及不同作用时间的TGF-β1进行诱导,四甲基氮唑比色法检测细胞增殖能力变化,蛋白印迹法检测Smad3、Smad7蛋白的表达变化。结果:JEG-3细胞对TGF-β1的诱导作用表现为良好的浓度效应和时间效应。100、200μg/LTGF-β1作用后,细胞增殖率显著增加(P<0.01),Smad3蛋白的相对表达量增加(P<0.05或P<0.01),Smad7蛋白无明显改变(P>0.05);同时100μg/LTGF-β1作用12h后,细胞增殖率显著增加,Smad3蛋白相对表达量增加(P<0.05或P<0.01),Smad7蛋白表达无改变(P>0.05)。结论:外源性TGF-β1能够促进绒毛膜癌JEG-3细胞的增殖,具有良好的浓度效应和时间效应;绒毛膜癌JEG-3细胞逃逸TGF-β1介导的生长抑制作用,可能是由于TGF-β1/Smads信号通路中的Smad3、Smad7蛋白发生异常而致。

信号蛋白Smad3在大鼠心肌肥厚过程中的表达

目的研究信号蛋白Smad3在大鼠心肌肥厚中的表达变化。方法结扎大鼠腹主动脉复制心肌肥厚模型,在不同时间点检测左心室重量指数(LVMI),RTPCR法检测肥大心肌组织中TGFβ1、Smad3的mRNA表达,Westernblotting以及免疫组化法检测Smad3蛋白的表达。结果术后3dLVMI开始上升并持续至28d,肥大心肌组织中TGFβ1、Smad3mRNA及蛋白表达术后3d开始上升,持续至28d,术后14d为表达高峰。结论信号蛋白Smad3参与了腹主动脉结扎诱导的大鼠心肌肥厚病理过程。

丹参酮ⅡA对肝癌细胞MHCC97-HSmad3/Smad7蛋白及上皮间质转化的影响

目的:探讨丹参酮ⅡA对肝癌细胞MHCC97-H Smad3、Smad7蛋白及上皮间质转移标志蛋白Ecadherin/N-cadherin表达水平及侵袭转移能力的影响。方法:10μM丹参酮ⅡA处理MHCC97-H细胞,实时定量PCR检测细检测Smad3、Smad7和snail的m RNA表达;用不同浓度丹参酮ⅡA及10%小牛血清对照组培养肝癌细胞MHCC97-H,48 h后,Western blot检测Smad3、p-Smad3、Smad7、Snail、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平。划痕法和Transwell小室检测肝癌细胞侵袭/迁移能力。结果:10μM丹参酮ⅡA处理MHCC97-H细胞,不同时间点检测Smad3、Smad7和snail的m RNA表达:结果显示,与0 h相比,48 h及72 h Smad7的表达量明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);Smad3及snail的差异无统计学意义。不同浓度丹参酮ⅡA处理MHCC97-H细胞48 h,Western blot检测Smad3、p-Smad3、Smad7、snail、E-cadherin、Ep CAm、N-cadherin和Vimentin蛋白表达:结果显示,与对照组相比,高浓度丹参酮ⅡA组(20μM)48 h的p-Smad3、Snail和N-cadherin、Vimentin明显降低,Smad7、E-cadherin和Ep CAM明显升高(P<0.05)。中浓度丹参酮ⅡA组(10μM)48 h的Smad7、E-cadherin和Ep CAM升高;p-Smad3、snail、Ncadherin和Vimentin降低(P<0.05)。低浓度丹参酮ⅡA组(5μM)48 h的E-cadherin升高,N-cadherin降低(P<0.05);而Smad3、p-Smad3及snail的结果与对照组无明显差异(P>0.05)。不同浓度的丹参酮ⅡA组和对照组(DMSO)Smad3的蛋白表达无影响。不同浓度的丹参酮ⅡA组均可以减少p-Smad3和增加E-cadherin的表达,且随着丹参酮ⅡA浓度增高p-Smad3的表达逐渐减少,E-cadherin的表达逐渐增加。划痕法结果显示,与对照组比较,24 h后中浓度和高浓度丹参酮ⅡA组肝癌细胞的划痕愈合较慢,差异均有统计学意义(P<0.05);48 h后中浓度和高浓度丹参酮ⅡA组与对照组相比,肝癌细胞的划痕愈合明显减慢,差异有统计学意义(P<0.01);且同等浓度丹参酮ⅡA组肝癌细胞的划痕愈合与24 h相比较,48 h肝癌细胞的划痕愈合减慢。transwell显示,与对照组相比,中浓度和高浓度丹参酮ⅡA处理细胞48 h可明显减少细胞的侵袭,差异有统计学意义(P<0.05)。而低浓度丹参酮ⅡA无明显影响,差异无统计学意义。结论:丹参酮ⅡA能抑制肝癌细胞侵袭转移,可能与与抑制Smad3蛋白磷酸化、上调Smad7蛋白,并抑制上皮间质转化有关。

靶向大鼠Smad3基因的siRNA筛选及其shRNA重组慢病毒的构建

目的设计并筛选针对大鼠Smad3基因的siRNA,构建靶向Smad3基因的shRNA重组慢病毒。方法针对大鼠Smad3基因设计并合成6对siRNA(siRNA001～006)及1对无关对照siRNA,转染大鼠肝细胞株BRL-3A,应用Western Blot检测各siRNA对SMAD3蛋白表达的抑制作用,挑选抑制效率高的siRNA。依据所得的序列合成并克隆到pLL3.7载体中,与包装质粒pRSV-rev、pMDLg-pRRE和VSV-G共转染293FT细胞获得靶向Smad3的慢病毒。通过流式细胞仪绿色荧光蛋白(GFP)荧光计数来检测病毒滴度。结果 Western Blot检测证实siRNA001、siRNA005、siRNA006对SMAD3蛋白表达的抑制作用明显,抑制率分别可达83.36%、86.99%及64.88%,而对照siRNA无明显作用。酶切和测序结果显示Smad3 shRNA及对照shRNA重组载体质粒pLL3.7-shRNA构建成功,将构建的质粒进行慢病毒包装可产生有感染活性的慢病毒颗粒。结论筛选出针对大鼠Smad3基因有明显抑制作用的3对siRNA,并成功构建表达相应shRNA的4种重组慢病毒,为研究调控Smad3的表达对肝再生或肝纤维化的影响提供了实验条件。

γ干扰素对实验性肝纤维化大鼠Smad3 mRNA的影响

目的初步探讨γ干扰素抗纤维化的分子机制。方法SD大鼠70只,模型对照组和γ干扰素治疗组注射40%CCl4油剂按0.3ml/100g皮下注射,2次/周,另设正常对照组大鼠10只。γ干扰素治疗组造模同时肌内注射γ干扰素0.2MU/kg,1次/日,模型对照组及正常对照组肌内注射生理盐水,连续干预12周。第12周末处死所有大鼠。取肝脏标本行常规苏木素-伊红和胶原染色,在光镜观察肝组织炎症活动度和肝纤维化情况并进行评分;实时荧光定量PCR方法检测大鼠肝脏Smad3mRNA的表达。结果肝组织炎症活动度和肝纤维化评分显示γ干扰素治疗组大鼠炎症程度、肝纤维化程度与模型对照组大鼠的肝组织炎症程度、肝纤维化程度比较显著改善(P<0.01,P<0.01)。荧光定量RT-PCR检测显示:与正常对照组Smad3mR-NA相比,模型对照组大鼠肝脏中Smad3mRNA表达显著增加(P<0.01);与模型对照组相比,γ干扰素组大鼠肝脏组织中Smad3mRNA表达明显减少(P<0.05)。结论γ干扰素抗实验性肝纤维化作用与下调Smad3mRNA来实现。干预转化生长因子β1信号转导过程是γ干扰素抗肝纤维化的机制之一。

Smad7,Smad3和Smad2在DEHP诱导的尿道下裂大鼠阴茎中的表达

目的研究Smads(7,3和2)在邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯[di-(2-ethylhexyl)phthalate,(DEHP)]诱导的尿道下裂大鼠阴茎组织中的表达变化,探讨尿道下裂发生机制。方法将SD孕鼠随机分为2组:实验组(将DEHP溶于1.5 mL大豆油中灌胃大鼠)和对照组(以1.5 mL大豆油灌胃大鼠),每组20只,自孕12 d(gestation day,GD12)至19 d(GD19)连续每天定时给药1次。至GD20行剖宫产取出雄性胎鼠,切取阴茎组织,采用实时定量PCR和免疫组化法分别检测胎鼠阴茎中Smad7,Smad3和Smad2三者mRNA和蛋白质表达水平。结果经qP CR检测分析后发现,Samd7,Smad3和Smad2三者mRNA在正常对照组相对于内参GAPDH的表达分别是1.00,0.84和1.14,在DEHP暴露组其相对表达分别是1.87,1.36和1.49,且三者在实验组的表达与正常对照组比较,均升高(P值分别为<0.001,0.041和0.021);观察实验组Smad7和p-Smad2/3蛋白表达水平亦有增加趋势。结论DEHP诱导的先天性尿道下裂可能与胎鼠阴茎组织中Smads(7,3和2)的过度表达有关。

TGF-β_1及其信号蛋白Smad3对大鼠心肌细胞肥大的作用

目的:探讨转化生长因子β1(transforming growth factor,TGF-β1)及其信号蛋白Smad3在诱导大鼠心肌细胞肥大中的作用。方法:培养新生大鼠心肌细胞,流式细胞仪检测心肌细胞总蛋白含量,RT-PCR法检测胚胎抗原ANF mRNA(atrial natriuretic factor)及Smad3 mRNA的表达,Western blotting检测Smad3蛋白的表达。结果:不同浓度TGF-β1均能明显增加心肌细胞总蛋白含量和ANF mRNA的表达,Smad3基因反义寡核苷酸能抑制TGF-β1诱导的心肌细胞肥大,TGF-β1诱导肥大的心肌细胞内信号蛋白Smad3表达的增加。结论:TGF-β1及其信号蛋白Smad3可能参与诱导大鼠心肌细胞肥大的病理过程。

贝那普利对糖尿病大鼠胰腺组织中TGF-β_1和Smad3表达的影响

目的研究贝那普利对糖尿病大鼠胰腺组织中TG F-β1和Sm ad3表达和R AS系统的影响。方法以健康成年W istar大鼠为实验对象,随机分为正常组、糖尿病未干预组和糖尿病贝那普利干预组3组。正常组以普通饲料喂养,糖尿病未干预组和糖尿病贝那普利干预组以高脂高糖饲料喂养。6周后腹腔注射链脲佐菌素诱导成糖尿病大鼠。于给药8周后处死。检测各组大鼠的血糖、胰岛素、体重。采用免疫组织化学方法检测胰腺组织中TG F-β1及Sm ad3蛋白的表达,并用彩色病理图像分析系统进行定量分析。采用放射免疫的方法检测胰腺组织中的血管紧张素Ⅱ的含量。结果与正常组相比,糖尿病未干预组血糖增加胰岛素分泌减少、体重减轻。TG F-β1及Sm ad3蛋白的表达明显增加。胰腺组织中的血管紧张素Ⅱ含量增加。贝那普利治疗后除体重无变化外上述指标均明显改善(P<0.05)。结论胰腺局部R AS系统和TG F-β1/Sm ad通路在糖尿病时是激活的,贝那普利治疗后可改善胰腺纤维化并可改善胰岛功能。

纤维化大鼠肝组织中SMAD3蛋白和ERK1的表达

目的:通过研究大鼠肝纤维化模型肝组织中细胞外信号调节激酶(Extracellularsignal-regulatedkinase,ERK)和SMAD3蛋白的表达及分布规律,初步探讨它们所介导的信号通路在肝纤维化发病机制中的作用。方法:雄性SD大鼠32只,质量250～300g,皮下注射CCl4制备大鼠肝纤维化模型,分别于注射CCl4后1、4、8周处理动物,采用免疫组织化学方法检测肝组织中ERK1和SMAD3蛋白的表达及分布。结果:ERK1和SMAD3蛋白均主要表达于肝星状细胞中。CCl4注射诱导后,大鼠肝组织中ERK1和SMAD3蛋白的表达较正常对照明显增强(P<0.05)。且CCl4注射1、4、8周组肝组织中两者的表达强度均呈明显的逐级递增的趋势(P<0.05)。结论:ERK信号通路的激活促进肝星状细胞活化增殖;与此同时,SMAD3蛋白介导的信号通路则可能与肝星状细胞的纤维化活性密切相关,两者共同促进大鼠肝纤维化的发生发展。

大鼠心肌肥厚过程中信号蛋白Smad3的变化

为研究SMAD信号通路在大鼠心肌肥厚中的作用 ,结扎大鼠腹主动脉复制心肌肥厚模型 ,在不同时间点检测左心室重量指数 (leftvertricularmassindex,LVMI) ,RT -PCR法检测肥大心肌组织中胚胎抗原心房利钠因子 (atrialna triureticfactor,ANF)的mRNA表达、转化生长因子β1(transforminggrowthfactor β1,TGF β1)及Smad3的mRNA表达 ,West ernblotting检测Smad3的蛋白表达。结果术后 3天LVMI开始上升并持续至 4周 ,肥大心肌组织中ANF、TGF β1、Smad3的mRNA表达水平以及Smad3的蛋白表达术后 3天开始上升 ,持续至 4周 ,术后 2周为表达高峰 (P <0 0 1)。

骨形态发生蛋白5对肝癌细胞生物学行为的影响及机制

目的 探究骨形态发生蛋白5(BMP5)对人肝癌细胞生物学行为的影响及机制。方法 将正常人肝细胞系L02与人肝癌细胞系Hep3B、Huh7置于37℃、5%CO_(2)细胞培养箱中培养,采用RT-qPCR法检测正常人肝细胞系L02与人肝癌细胞系Hep3B、Huh7中BMP5 mRNA表达。将肝癌细胞系Hep3B、Huh7分为对照(NC)组及低、中、高剂量组,低、中、高剂量组分别用1、10、100 ng/mL浓度的重组人骨形态发生蛋白5(rh-BMP5)处理细胞,通过CCK-8法检测细胞增殖,Annexin-V/PI流式细胞术检测细胞凋亡,划痕实验检测细胞迁移,Western blotting法检测增殖细胞核抗原PCNA和SMAD通路关键蛋白及其磷酸化(SMAD3、p-SMAD3)表达。结果 与正常肝细胞系L02相比,BMP5在肝癌细胞系Hep3B、Huh7中表达升高(P均<0.05)。与NC组相比,中、高剂量组rh-BMP5可促进Hep3B、Huh7细胞增殖和PCNA表达上调(P均<0.05),高剂量组100 ng/mL的rh-BMP5处理肝癌细胞24及48 h细胞凋亡率降低、迁移率增高(P均<0.05)。高剂量组与NC组相比,p-SMAD3表达升高(P<0.05)。结论 BMP5在肝癌细胞系中高表达,可能通过增强SMAD3活化促进肝癌细胞Hep3B、Huh7的增殖、迁移并抑制凋亡。

野菊花提取物对慢性支气管炎大鼠肺组织病理的影响及对TGF⁃β1/Smad3通路的调控机制

目的观察野菊花提取物对慢性支气管炎大鼠肺组织病理的影响,并探讨其对肺组织转化生长因子-β1(TGFβ1)/信号传导蛋白Smad3通路的调控机制。方法取60只成年健康SD大鼠,除正常组外均建模,低、中、高浓度组予以0.7、1.4、2.8 g/kg野菊花提取物灌胃,每天1次;阳性组予以50 mg/kg N-乙酰半胱氨酸灌胃,每天1次。观察干预前后血清TGF-β1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)水平变化,肺组织病理改变,肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达。结果干预前,模型组血清TGF-β1、TNF-α、IL-6较正常组升高(P<0.01)。干预后,模型组依然升高(P<0.01),野菊花提取物组和阳性组均较干预前水平降低(P<0.05),且低于模型组(P<0.01);正常组肺组织无明显改变,模型组呈病理改变,野菊花提取物组和阳性组均较模型组减轻,且高浓度组与正常组最为接近;各组病变评分比较,模型组均高于正常组(P<0.01),野菊花提取物组和阳性组均低于模型组(P<0.01);各组肺组织TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白表达比较,模型组均高于正常组(P<0.01),野菊花提取物组和阳性组均低于模型组(P<0.01)。结论野菊花提取物可减轻慢性支气管炎大鼠的炎症反应和肺组织病理变化,推测与下调TGF-β1、Smad3 mRNA及蛋白有关。

TGF-β1/Smad3对辐射所致鼻咽癌细胞凋亡及细胞周期分布的影响

目的探讨TGF-β1/Smad3在辐射所致鼻咽癌细胞CNE-2凋亡中的作用及其机制。方法 CNE-2细胞分为6 Gy照射组、TGF-β1+6 Gy照射组以及对照组,免疫荧光方法检测γH2AX焦点形成试验,流式细胞仪检测凋亡细胞及细胞周期分布,MTS法检测细胞生长生长活力,绘制生长曲线并计算生长增殖率。Western blot检测P-ATM、pCHK1、pCHK2、CDC25A、p-Smad3、Smad3、P15和CDK4蛋白表达水平。结果照射组及TGF-β1+6Gy照射组凋亡细胞数明显增多,细胞核体积缩小,可见浓染致密的γH2AX表达。TGF-β1+6 Gy照射组的γH2AX表达相对于对照组与6 Gy照射组明显增加。6 Gy照射组和TGF-β1+6 Gy照射组的G2/M期细胞比例均明显高于对照组(P<0.05)。TGF-β1+6 Gy照射组与6 Gy照射组相比,S期明显增加(P<0.05)。TGF-β1+6Gy照射组和6 Gy照射组的凋亡及坏死细胞比对照组的明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。TGF-β1+6Gy照射组的凋亡和坏死细胞比例明显比6 Gy照射组增加,差异有统计学意义(t P<0.05)。对照组、6 Gy照射组和TGF-β1+6 Gy组的CNE-2细胞克隆形成率分别为0.60、0.03和0.01,与对照组相比,6 Gy照射组和TGF-β1+6 Gy照射组的细胞克隆形成明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。与6 Gy照射组相比,TGF-β1+6 Gy照射组的细胞形成率减少,差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot结果显示TGF-β1处理组相对于单独6Gy照射组,p-ATM、p-CHK1、p-CHK2、P15、p-Smad3、CDC25A及CDK4表达下调,Smad3表达无明显变化。结论 TGF-β1可增加照射所致鼻咽癌细胞的凋亡,可能与增加S期细胞比例以及抑制Smad3磷酸化同时促进ATM磷酸化有关。

健脾化瘀法含药血清对肝癌细胞Smad3蛋白及EMT的影响

目的:探讨健脾化瘀法含药血清对肝癌细胞Smad3蛋白磷酸化及上皮间质转移标志蛋白E-cadherin/Ncadherin表达水平及侵袭转移能力的影响。方法:分别以不同浓度(10%和20%)健脾化瘀法中药含药血清及10%小牛血清对照组培养肝癌细胞MHCC97-H,实时定量PCR检测细胞Smad3和Snail mRNA水平,Western blot检测Smad3、p-Smad3、Snail、E-cadherin和N-cadherin蛋白表达水平。划痕法和Transwell小室检测肝癌细胞侵袭/迁移能力。结果:实时定量PCR结果显示高浓度组(20%含药血清组)、低浓度组(10%含药血清组)和对照组(10%小牛血清对照)Smad3的mRNA水平分别为0.87±0.24、0.97±0.28和1.18±0.34(P>0.05);高浓度组Snail的mRNA水平低于对照组(0.49±0.05 vs.1.10±0.21,P=0.034)。与对照组相比,高浓度含药血清组48h的p-Smad3、Snail和N-cadherin明显降低,E-cadherin明显升高(P<0.05)。与对照组相比,低浓度含药血清组48h的E-cadherin升高,N-cadherin降低(P<0.05);而Smad3、p-Smad3及snail的结果与对照组无明显差异(P>0.05)。划痕法结果显示,与对照组比较,20%含药血清组及10%含药血清组肝癌细胞的划痕愈合较慢,差异均有统计学意义(P<0.05)。Transwell显示与对照组相比,20%含药血清组及10%含药血清组MHCC97-H细胞的迁移受抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:健脾化瘀法中药能抑制肝癌细胞侵袭转移,可能与抑制Smad3蛋白磷酸化及上皮间质转化有关。