昆仙胶囊联合吲哚美辛通过抑制BMP4/Smad5信号通路治疗创伤性骨化性肌炎模型大鼠的研究

目的 探讨昆仙胶囊联合吲哚美辛治疗创伤性骨化性肌炎模型大鼠的可能作用机制。方法96只雄性SD大鼠通过切断跟腱和破坏踝关节建立骨化性肌炎模型,按随机数字表法分为对照组、中药组、西药组、中西药联合组,每组24只;术后当天,对照组、中药组、西药组、中西药联合组分别给予0.2 g/50 mL安慰剂、0.3 g/50 mL昆仙胶囊粉剂溶液、0.1 g/50 mL吲哚美辛粉剂溶液、0.3g/50 mL昆仙胶囊粉剂和0.1 g/50 mL吲哚美辛粉剂混合溶液进行灌胃,每天1次,每次2 mL,时间2~8周。在术后2、4、6、8周,每组各断颈处死6只大鼠,测量踝关节肿胀厚度,取血清用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转化生长因子-β(TGF-β)水平,取跟腱组织用免疫组化检测骨成型蛋白4(BMP4)和Smad5蛋白表达。结果 与对照组同一时间点比较,中西药联合组4周时[(10.77±0.88)mm比(13.78±0.91)mm,P<0.05],中药组、西药组、中西药联合组6周[(11.82±1.08)mm、(11.34±0.88)mm、(8.97±0.53)mm比(12.97±0.51)mm,P均<0.05]、8周时[(9.39±0.90)mm、(9.47±0.45)mm、(8.47±0.38)mm比(12.25±0.89)mm,P均<0.05]踝关节肿胀厚度均降低。与对照组同一时间点比较,中药组、西药组、中西药联合组4周[(374.33±31.48)ng/L、(331.83±47.11)ng/L、(337.66±46.86)ng/L比(453.16±53.11)ng/L,P均<0.05]、6周[(346.66±47.84)ng/L、(304.50±26.25)ng/L、(277.33±44.79)ng/L比(417.00±32.58)ng/L,P均<0.05]、8周[(307.16±24.46)ng/L、(283.33±34.85)ng/L、(169.50±31.64)ng/L比(384.83±42.22)ng/L,P均<0.05]血清TGF-β浓度均降低。与对照组同一时间点比较,中药组和中西药联合组4周时[(148.18±15.88)、(146.01±14.33)比(189.41±14.40),P均<0.05]、中药组、西药组和中西药联合组6周[(137.00±8.95)、(123.15±22.93)、(112.53±35.93)比(172.98±7.56),P均<0.05]、8周时[(128.21±12.85)、(117.58±21.34)、(96.04±21.33)比(157.95±10.41),P均<0.05]跟腱组织BMP4平均光密度(AOD)均降低。与对照组同一时间点相比,中药组、西药组和中西药联合组4周[(92.65±12.96)、(96.97±12.85)、(93.61±11.44)比(121.01±10.23),P均<0.05]、6周时[(85.23±12.73)、(87.73±13.07)、(76.96±12.71)比(114.18±10.29),P均<0.05]、中药组和中西药联合组8周时[(79.91±13.19)、(76.17±21.18)比(94.74±19.93),P均<0.05]跟腱组织Smad5AOD均降低。结论 昆仙胶囊联合吲哚美辛对创伤性骨化性肌炎的抑制效果有增益作用,其机理可能和调控BMP4/Smad5信号通路有关。

miR-24-3p、Smad5与骨质疏松性脊柱骨折患者PVP术后骨折愈合的相关性

目的探讨miR-24-3p、Smad5与骨质疏松性脊柱骨折患者经皮椎体成形术(percutaneous vertebro plasty,PVP)术后骨折愈合的相关性。方法选取2019年10月~2021年10月中国人民解放军陆军第七十二集团军医院收治的骨质疏松性脊柱骨折且接受PVP治疗的患者98例作为研究对象,并依照术后3个月骨折愈合情况将患者分为延迟组(n=26)和愈合组(n=72)。比较两组患者的miR-24-3p、Smad5 mRNA表达水平、骨密度(bone mineral density,BMD)情况以及骨折愈合相关指标,并进行相关性分析。结果两组患者术后3个月的miR-24-3p表达水平明显低于术后3天,且愈合组明显低于延迟组(P<0.05);两组患者术后3个月的Smad5 mRNA表达水平明显高于术后3天,且愈合组明显高于延迟组(P<0.05)。与愈合组比较,延迟组患者术后3个月腰椎BMD、股骨颈BMD、椎体前缘高度明显降低,而Cobb角变化、Oswestry功能障碍指数(oswestry disability index,ODI)、视觉模拟量表(visual analogue scale,VAS)评分均明显升高(P<0.05)。Pearson相关性分析显示,患者PVP术后3个月miR-24-3p与腰椎BMD、股骨颈BMD呈负相关,与Cobb角、ODI、VAS评分呈正相关(P<0.05);而Smad5 mRNA与腰椎BMD、股骨颈BMD、椎体前缘高度恢复率呈正相关,与Cobb角、ODI、VAS评分呈负相关(P<0.05)。miR-24-3p、Smad5mRNA ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.885、0.881。结论骨质疏松性脊柱骨折患者PVP术后发生骨折延迟愈合,可能与血清中miR-24-3p呈高表达、Smad5mRNA呈低表达有关。

LncRNA XIST调节miR-545-3p/SMAD5轴对人成骨细胞增殖、迁移及成骨分化的影响

目的探讨长链非编码RNA X染色体失活特异转录本(lncRNA XIST)调控miR-545-3p/SMAD5轴对人成骨细胞(hOB)增殖、迁移及成骨分化的影响。方法将hOB细胞分为ctrl组、pcDNA组、pcDNA-XIST组、pcDNA-XIST+miR-NC组、pcDNA-XIST+miR-545-3p mimic组;qRT-PCR检测细胞中XIST、miR-545-3p表达;CCK-8法检测细胞增殖;划痕实验检测细胞迁移;Western blot检测细胞中SMAD5、碱性磷酸酶(ALP)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨钙素(OCN)蛋白及细胞核中p-SMAD5蛋白表达;茜素红S染色检测矿化结节形成;双荧光素酶报告基因实验分别验证XIST和miR-545-3p、miR-545-3p和SMAD5的关系。结果与ctrl组、pcDNA组比较,pcDNA-XIST组hOB细胞中XIST表达、OD_(450)值(48、72 h)、划痕愈合率、SMAD5、ALP、Runx2、OCN蛋白及核p-SMAD5蛋白表达升高,miR-545-3p表达降低,矿化结节形成增多(P<0.05);上调miR-545-3p减弱了过表达XIST对hOB细胞增殖、迁移及成骨分化的促进作用;XIST靶向负调控miR-545-3p表达,miR-545-3p靶向调控SMAD5表达。结论过表达XIST可能通过海绵化miR-545-3p来上调SMAD5表达,进而促进hOB细胞增殖、迁移及成骨分化。

血清miR-155和Smad5水平对急性肾衰竭血液透析患者的预后价值评估

目的 分析血清miR-155和Smad5水平对急性肾衰竭血液透析患者的预后评估价值。方法 本研究选取2018年8月至2019年7月恩施土家族苗族自治州中心医院收治的接受血液透析的急性肾衰竭患者120例作为研究组,另选取健康体检者116名作为对照组,根据3年的电话随访记录患者是否存活分为存活组和死亡组;采用定量反转录PCR(quantitative reverse transcriptase-mediated PCR,qRT-PCR)法检测血清miR-155和Smad5 mRNA的表达水平;采用Pearson法分析血清miR-155和Smad5 mRNA表达水平的相关性以及二者与肌酐和尿素氮的相关性;采用Kaplan-Meier对急性肾衰竭血液透析患者的生存情况进行分析。用Cox回归分析影响急性肾衰竭血液透析患者预后的因素;受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)分析血清mi R-155和Smad5 mRNA水平对急性肾衰竭血液透析患者预后的预测价值。结果 研究组血清mi R-155[(2.65±0.71)比(1.01±0.24)]、肌酐[(289.32±35.64)μmoL/L比(87.65±10.32)μmoL/L]和尿素氮[(14.78±3.69)mmoL/L比(5.69±1.23)mmoL/L]水平显著高于对照组(P<0.05),Smad5 mRNA[(0.78±0.21)比(1.02±0.23)]水平显著低于对照组(P<0.05)。根据Pearson相关性分析,血清miR-155和Smad5 mRNA水平呈负相关(r=-0.538,P<0.05),血清miR-155表达水平与肌酐、尿素氮水平呈正相关(r=0.489、0.532,P均<0.05),血清Smad5 mRNA表达水平与肌酐、尿素氮水平呈负相关(r=-0.475、-0.558, P均<0.05)。存活组血清miR-155[(2.38±0.59)和(3.22±0.90)]和肌酐[(223.21±29.35)μmoL/L和(426.62±48.32)μmoL/L]和尿素氮[(11.95±3.15)mmoL/L和(20.67±4.78)mmoL/L]的水平显著低于死亡组(P<0.05),Smad5 mRNA[(0.84±0.23)和(0.67±0.18)]的表达水平显著高于死亡组(P<0.05)。根据Kaplan-Meier生存曲线分析表明,miR-155高表达组生存率显著低于低表达组(χ^(2)=4.219,P=0.040),Smad5 mRNA高表达组生存率显著高于低表达组(χ^(2)=7.590,P=0.006)。根据Cox回归分析得知,miR-155、Smad5 mRNA、肌酐和尿素氮是影响急性肾衰竭血液透析患者预后的危险因素(P<0.05)。血清miR-155预测急性肾衰竭血液透析患者预后的曲线下面积为0.824,血清Smad5 mRNA预测急性肾衰竭血液透析患者预后的AUC为0.851,二者联合预测急性肾衰竭血液透析患者预后的AUC为0.930,二者联合优于血清miR-155和Smad5 mRNA各自单独预测(Z联合vs miR-155=3.543、Z联合vs Smad5 mRNA=4.325,P均<0.05)。结论 miR-155高表达和Smad5低表达是影响急性肾衰竭血液透析患者预后的危险因素,二者联合检测可以更好地评估患者的预后情况。

lncRNA SMAD5-AS1在肺腺癌细胞中的表达及其通过Wnt/β-catenin通路对癌细胞增殖、侵袭、迁移的影响

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)SMAD家族成员5反义RNA1(SMAD5-AS1)在肺腺癌(LUAD)中的表达及其对LUAD细胞恶性生物学行为的影响,并分析其潜在机制。方法通过生物信息学网站对LUAD组织中lncRNA SMAD5-AS1的表达进行分析;应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测72例LUAD组织与邻近正常组织以及人正常支气管上皮细胞(BEAS-2B)与人LUAD细胞(SPC-A-1、A549、H1299、LTEP-a-2)中lncRNA SMAD5-AS1表达水平。体外培养对数生长期的SPC-A-1和H1299细胞,分为SPC-A-1对照组(SPC-A-1-Ctr组)、SPC-A-1+sh-NC组、SPC-A-1+sh-SMAD5-AS1组、H1299对照组(H1299-Ctr组)、H1299+LV5-NC组、H1299+LV5-SMAD5-AS1组。采用携带lncRNA SMAD5-AS1敲除的短发夹RNA(sh-SMAD5-AS1)和lncRNA SMAD5-AS1过表达的重组质粒(LV5-SMAD5-AS1)及相应空载体的重组慢病毒转染细胞,qRT-PCR验证转染效率;5-乙炔基-2′-脱氧尿苷(EdU)测定细胞增殖活性;划痕愈合实验和Transwell小室实验检测细胞迁移、侵袭能力;Western blot检测细胞上皮间质转化(EMT)和Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路相关蛋白[E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、β-catenin]的表达。结果lncRNA SMAD5-AS1在LUAD组织和细胞中呈高表达(均P<0.05);敲低lncRNA SMAD5-AS1表达后,SPC-A-1细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力及N-cadherin、Vimentin和细胞核β-catenin蛋白水平显著降低(均P<0.05),E-cadherin和GSK-3β蛋白水平显著升高(均P<0.05);过表达lncRNA SMAD5-AS1后,H1299细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力及N-cadherin、Vimentin和细胞核β-catenin蛋白水平显著升高(均P<0.05),E-cadherin和GSK-3β蛋白水平显著降低(均P<0.05)。结论lncRNA SMAD5-AS1在LUAD中高表达,其可能通过激活Wnt/β-catenin通路促进LUAD细胞增殖、迁移、侵袭和EMT。

Smad5基因敲除小鼠听生理和耳蜗形态实验观察

目的观察Smad5基因敲除小鼠(Smad5+/-)听生理和耳蜗形态改变,探讨Smad5基因是否为一种新的听功能相关基因。方法双盲对照法对Smad5(+/-)和Smad5(+/+)小鼠进行听性脑干诱发电位(ABRs)的听阈检测和耳蜗毛细胞形态观察及毛细胞计数。结果ABR听阈Smad5(+/-)小鼠24周时为90.63±17.65dB(SPL),Smad5(+/+)小鼠为63±19.94dB(SPL),二者差异显著(P<0.01)。耳蜗基底膜铺片显示Smad5(+/-)小鼠内、外毛细胞缺失,其中在底回处尤其突出,Smad5(+/+)小鼠内、外毛细胞少量缺失。Smad5(+/-)与Smad5(+/+)小鼠外毛细胞计数差异有显著性意义(P<0.01),而内毛细胞计数差异无显著意义(P>0.05)。结论Smad5基因敲除导致小鼠中、重度听力下降,耳蜗基底膜毛细胞缺失,以外毛细胞为主。Smad5基因敲除导致毛细胞缺失是Smad5(+/-)小鼠听力损失的原因之一。推测Smad5基因可能是听功能相关基因。

MiR-155调控Smad5促进糖尿病肾病肾脏纤维化作用

目的探讨MiR-155调控Smad5在糖尿病肾病(DN)肾脏纤维化的作用。方法应用荧光定量PCR及原位杂交检测miR-155在DN肾组织中的表达。采用生物信息学预测miR-155的靶基因,并通过Western Blot及检测双荧光素酶报告基因活性进行验证。采用Western Blot检测DN系膜细胞增殖及系膜基质相关标志蛋白的表达。结果 (1)MiR-155在DN肾组织及高糖刺激的肾实质细胞中均表达升高。(2)MiR-155靶向调控Smad5基因表达。(3)MiR-155通过下调Smad5表达促进系膜细胞增殖及细胞外基质增加。结论 MiR-155通过调控Smad5基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化,为深入认识DN的发病机制提供了依据。

Smad1、Smad5在肾阳虚不育大鼠睾丸中表达的研究

目的: 观察Smad1、Smad5在腺嘌呤诱导的肾阳虚不育大鼠睾丸中的表达,探讨肾阳虚不育的病理机制,为防治男性不育提供可靠的实验依据。 方法: 60d雄性SD大鼠 48只,随机分为 6组(肾阳虚 7、14、21d组;正常对照7、14、21d组),每组 8只。以腺嘌呤 300mg/kg给大鼠灌胃,诱导肾阳虚不育大鼠模型,于灌胃第 7、14、21d,用免疫组化SABC法测定Smad1、Smad5在其睾丸中的表达。 结果: Smad1表达见于所有正常对照组及模型组大鼠睾丸各级生精细胞的胞质内,支持细胞及间质细胞未见表达;灌胃第 7、14d与正常对照组相比差异无显著性(P>0. 05),第 21d的表达较正常对照组及第 7、14d明显减弱(P<0. 05)。Smad5表达见于正常对照组及腺嘌呤灌胃第 7d大鼠睾丸的初级精母细胞及精原细胞的胞核内,两组比较差异无显著性(P>0. 05),其余各级生精细胞、支持细胞及间质细胞均未见表达;灌胃第 14、21d大鼠睾丸中未见Smad5表达。 结论: 肾阳虚大鼠睾丸中Smad1表达的减弱及Smad5的无表达,可能是导致其不育的病理机制之一。

Smad5基因在小鼠耳蜗中的表达及定位

目的了解Smad5基因在小鼠耳蜗中的表达及定位。方法应用RTPCR检测Smad5基因的表达,用原位杂交法检测耳蜗中Smad5mRNA的表达部位,用免疫组织化学方法确定Smad5蛋白在耳蜗中的定位。结果Smad5基因在小鼠耳蜗中有高表达,表达部位在毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜等。结论Smad5在耳蜗中存在,是耳蜗中众多蛋白中的一种。它可能在耳蜗的形成、毛细胞的分化过程中起着重要的作用。

成年大鼠睾丸Smad1和Smad5的免疫组织化学研究

目的 :探讨骨形态形成蛋白的细胞内信号传导分子Smad1和Smad5蛋白在成年大鼠睾丸内的表达。 方法 :应用免疫组织化学ABC法结合葡萄糖氧化酶 DAB 硫酸镍铵增强技术 ,检测成年大鼠睾丸Smad1和Smad5蛋白的表达和定位。 结果 :Smad1蛋白表达于大鼠睾丸精曲小管的各级生精细胞的胞质内 ,呈淡染的紫蓝色颗粒 ,胞核为阴性 ,免疫染色阳性细胞主要包括精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞 ;而Smad5蛋白阳性染色不明显 ,只有睾丸间质细胞呈弱阳性反应 ,免疫反应阳性物质主要定位于细胞质。 结论 :Smad1蛋白主要表达于睾丸精曲小管各级生精细胞 ,Smad5蛋白表达于间质细胞 ,为揭示TGF β超家族在精子发生中的分子机理提供了直接证据。

微小RNA-135b调控Smad5在糖尿病肾病发病中的作用研究

目的探讨微小RNA-135b(miR-135b)在糖尿病肾病(DN)发病中的作用及可能机制。方法应用荧光定量PCR及原位杂交检测miR-135b在DN肾组织中的表达。采用生物信息学预测miR-135b的靶基因,并通过蛋白免疫印迹法及检测双荧光素酶报告基因活性进行验证。同时行蛋白免疫印迹法检测DN系膜细胞增殖及系膜基质相关标志蛋白的表达。结果实时定量PCR显示,miR-135b在DN肾组织中表达较正常肾组织升高(P<0.05)。原位杂交显示,miR-135b在DN肾组织中表达较正常肾组织增强,且其表达主要位于肾小球系膜细胞及肾小管上皮细胞的胞浆和胞核中。人肾小管上皮细胞HMC及人系膜细胞HK-2在高糖培养24 h时均能上调miR-135b的表达,48 h升高更显著,与同时点正常对照培养的HMC及HK-2比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。人源和鼠源的Smad5 3'-非翻译区与miR-135b种子序列的8个碱基UUUCGGUA完全互补。miR-135b模拟物可下调Smad5的蛋白表达水平,而miR-135b抑制物对Smad5的蛋白表达无影响。将Smad5 3'-非翻译区野生型和突变型质粒分别转染入HMC及HK-2,并同时转染miR-135b模拟物,发现miR-135b模拟物能抑制Smad5 3'-非翻译区野生型荧光素酶活性,但对Smad5 3'-非翻译区突变体的荧光素酶活性无影响。miR-135b促进系膜细胞增殖及系膜基质增加HMC细胞转染miR-135b模拟物,可有效下调其靶蛋白Smad5的表达,同时上调增殖核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白(Cyclin D1)表达,且使细胞周期蛋白依赖性激酶的抑制蛋白p21表达降低(P均<0.05),但转染miR-135b抑制物对PCNA、Cyclin D1、p21的表达无影响(P均>0.05)。结论 MiR-135b通过调控Smad5基因促进系膜细胞增殖及肾脏纤维化。

Smad5基因缺陷导致小鼠听力重度损失

目的观察Smad5基因敲除小鼠听功能的变化及其特点。方法50只Smad5基因敲除的杂合子小鼠与25只野生型小鼠分成5组:2周、4周、8周、12周、24周组。分别行脑干诱发电位(ABR)检测,刺激声用click及toneburst(8kHz,16kHz,32kHz)。结果Smad5基因敲除杂合子小鼠2周、4周、8周、12周、24周click刺激ABR平均听阈分别为93±2.78dBSPL;38.7±2.58dBSPL;64.8±3.78dBSPL;81.5±2.48dBSPL;95.7±4.78dBSPL。野生型小鼠平均听阈分别为99±2.78dBSPL;38±3.65dBSPL;32±1.78dBSPL;32±2.70dBSPL;47±5.78dBSPL。经统计学处理,除2周和4周组P>0.05两者听阈差异无显著性外,其他时间段P<0.01,说明基因敲除小鼠与野生型小鼠听阈差异有显著性。toneburst(8kHz,16kHz,32kHz)结果与click刺激ABR听阈结果基本一致。结论Smad5基因敲除导致小鼠随月龄增加而听力损失加重。

Smad5基因敲除小鼠耳蜗扫描电镜观察

目的观察Smad5基因敲除杂合(3月组2只小鼠4只耳蜗)子小鼠内耳形态学超微结构变化。方法野生型动物组:1个月组4只小鼠5只耳蜗,2个月组及3个月组各有2只小鼠4只耳蜗;杂合子动物组1个月组3只小鼠3只耳蜗,2个月组2只小鼠4只耳蜗,3个月组3只小鼠6只耳蜗。按常规方法制成标本作扫描电镜观察。结果Smad5基因敲除杂合子小鼠扫描电镜观察:1月组耳蜗中均观察到耳蜗第一和第二圈外毛细胞有不同程度的静纤毛融合,未见外毛细胞缺失,内毛细胞未见明显地病理变化。2月组耳蜗中观察到第一和第二圈均可见内外毛细胞静纤毛不同程度缺失,有的部位以内毛细胞静纤毛缺失为主,而有的部位以外毛细胞静纤毛缺失为主,有的以片状缺失为主,有的则以散在性缺失为主。3个月组3只小鼠6只耳蜗中均观察到不同程度第一和第二圈内外毛细胞静纤毛广泛性缺失,有外毛细胞缺失的部位多,以第一排外毛细胞的静纤毛缺失为主,第二和第三排外毛细胞静纤毛多以散在性缺失为主,有内毛细胞缺失的部位多伴有外毛细胞静纤毛的大片状缺失。野生型动物组扫描电镜观察:1个月组4只小鼠5只耳蜗,2个月组2只小鼠4只耳蜗均未观察到内外毛细胞缺失和静纤毛的变化,3月组有少量的外毛细胞缺失。结论野生型小鼠2个月以内耳蜗毛细胞无明显变化.杂合子小鼠随着月龄的增加内外毛细胞缺失的程度逐渐加重。

Smad5基因在小鼠耳蜗胚胎发育中的作用

目的检测Smad5基因在小鼠耳蜗胚胎发育中的作用。方法选用耳廓反应灵敏、健康的C57BL/6小鼠作为种鼠交配,用观察阴栓方法获得胚胎9天到20天的胎鼠,≤17天取胚胎头,≥18天在显微镜下取耳蜗,胚胎头水平冰冻切片,耳蜗平行于蜗轴冰冻切片,HE染色方法观察小鼠内耳发育形态演变过程,免疫组织化学方法检测Smad5蛋白在小鼠胚胎10～20天的表达情况。结果胚胎10天,听泡发育,胚胎12天听泡下部有蜗管始基形成并开始发育。胚胎18天,蜗管发育了2圈,形成了可以辨认的内、外毛细胞,血管纹开始分化。Smad5在小鼠内耳胚胎发育全程均有阳性表达,且表达比较广泛,尤其早期在整个听囊均有表达。在胚胎15～17天,主要集中在即将发育成基底膜听觉感受器的部分。在胚胎发育中后期在内外毛细胞、螺旋神经节细胞、支持细胞、血管纹、基底膜、前庭膜等也有表达。结论Smad5参与小鼠耳蜗胚胎发育全过程,它可能为听觉的发生所必需的基因。

Smad6信号干扰对MSCs骨向分化中Smad5及Smurf1基因表达的影响

目的研究在骨形态发生蛋白2(BMP-2)诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)骨向分化中Smad6信号干扰对Smad5、Smurf1基因表达的影响。方法培养小鼠骨髓MSCs,并分为3组:A组为对照细胞;B组细胞用携带绿色荧光蛋白(GFP)的空白载体病毒转染+BMP-2骨向诱导;C组细胞用Smad6重组RNA干扰载体转染+BMP-2诱导。结果病毒转染后GFP在MSCs中有效表达,病毒转染效率接近100%。与A组比较,BMP-2诱导24h显著提高了B组Smurf1 mRNA水平(P<0.01);而Smad6信号干扰在两个时间点则进一步提高了C组Smurf1 mRNA水平,并显著高于B组(P<0.01)。C组磷酸化的Smad5(pSmad5)和Smurf1水平在两个时间点也显著高于B组(P<0.01),而Smad5蛋白水平则未受影响。结论在BMP-2诱导的MSCs骨向分化中,Smad6 RNA干扰可促进Smad5磷酸化,并引起Smurf1基因表达代偿性增高。

SMAD5基因在中国耳聋患者中的突变筛查研究

目的探讨SMAD5基因与中国耳聋人群的相关性。方法采集听力诊断中心143名耳聋患者的外周静脉血,提取基因组DNA。选取听力正常的对照组149人。应用Primer3在线引物设计软件在SMAD5基因的编码区及其毗邻的内含子区域设计6对引物进行PCR(Polymerasechainreaction)扩增反应。PCR产物直接测序,测序结果应用DNAStar软件进行序列比对分析。统计处理应用STATA8.0软件。结果143名耳聋患者中含有8种听力损失表型,其中感音神经性聋及先天性聋患者达到32名。PCR扩增SMAD5基因,在内含子中发现5种SNP,进行基于群体资料的关联分析,结果显示这5种SNP与致病基因不存在显著关联。结论在本研究选择的各种耳聋表型患者中未发现SMAD5基因与其关联,说明SMAD5在本组研究中尚未显示其与耳聋相关的直接证据,但不能完全排除其在人类听觉基因调控网络中的作用(如与耳聋疾病位点处在连锁平衡状态或不与耳聋疾病位点连锁)。

人牙乳头细胞内Smad5蛋白表达的免疫组化研究

目的 :观察Smad5蛋白在体外原代培养的人牙乳头细胞内的表达及其在转化生长因子 - β超家族信号转导中的作用。方法 :原代培养的人牙乳头细胞 ,分别以骨形成蛋白 - 2 (bonemorphogeneticprotein -2 ,BMP - 2 )和转化生长因子 - β1(transforminggrowthfactor- β1,TGF - β1)刺激 ,免疫组化检测Smad5的表达 ,图像分析仪半定量。结果 :人牙乳头细胞 (空白对照组 )胞浆内可见Smad5阳性表达 ,胞核内未见阳性表达 ;BMP- 2实验组胞核内Smad5强阳性表达 ,胞浆内为弱阳性表达 ;TGF - β1实验组细胞胞浆Smad5阳性 ,胞核未见表达。结论 :人牙乳头细胞内存在Smad5的表达 ,Smad5能转导BMP - 2信号至核内发挥作用 ,但不能转导TGF -β1信号 ,提示BMP - 2在牙齿发育过程中信号传递可能是通过Smad5的信号转导途径实现的。

Smad5基因敲除对小鼠前庭功能的影响

目的观察Smad5基因敲除对小鼠前庭功能的影响,探讨Smad5基因是否为前庭功能相关基因。方法参照Petrosini报告的动物失衡行为评分方法,观察28只实验小鼠的平衡状态。对头偏,躯干卷曲,肢体外展,强迫环形运动,头震等五项前庭失衡症状进行综合评分。20只Smad5基因缺陷小鼠(+/-)和15只野生鼠(+/+)进行颈髓硬膜表面短声诱发电位检测前庭功能。结果动物失衡行为评分方法进行综合评分,两组实验小鼠得分均为0分,表明两组动物在平衡功能粗测上无明显异常。颈髓硬膜表面短声诱发电位(CDM-CEP)检测Smad5(+/-)小鼠峰值潜伏期在85dBSPL、95dBSPL和105dBSPL分别为6.85±0.23ms、6.78±0.20ms和6.70±0.43ms。Smad5(+/+)小鼠峰值潜伏期在85dBSPL、95dBSPL和105dBSPL分别为6.15±0.23ms、6.12±0.20ms和6.37±0.43ms。结论Smad5基因敲除导致CDM-CEP的潜伏期延长,表明Smad5基因敲除对小鼠的前庭功能有一定影响。

密骨胶囊对自然衰老雄性大鼠骨髓Smadl、Smad5、Smad6基因表达的影响

目的研究密骨胶囊对自然衰老雄性大鼠股骨骨髓中Smadl、Smad5、Smad6基因表达的影响。方法取12月龄自然衰老SD雄性大鼠100只随机分为2组，每组50只。自鼠龄12月龄始，分别给予生理盐水、密骨胶囊灌胃，在鼠龄14、16、18、20、22月龄时，每组各取10只大鼠，取右股骨，DEXA检测BMD，取左股骨骨髓，RT—PCR半定量检测Smadl、Smad5、Smad6基因表达。结果在14～22月龄阶段，密骨胶囊组与空白对照组相比较，密骨胶囊可维持股骨BMD（P=0．797），上调Smadl、Smad5mRNA表达水平（P〈0．01），下调Smad6mRNA表达水平（P〈O．01）。结论密骨胶囊可以上调股骨骨髓中Smadl、Smad5基因表达水平，下调Smad6基因表达水平，这可能是其促骨形成、修复骨损伤作用的分子机制之一。

补肾健脾活血方对成骨细胞增殖分化及BMP-2、Smad5影响的研究

目的:研究中药复方补肾健脾活血方对大鼠成骨细胞增殖分化及骨形成蛋白-2 (BMP-2)、Smad5表达的影响。方法:将60只3月龄雌性SD大鼠随机分为空白组、补肾健脾活血方组、阿仑膦酸钠组,每组20只。制备对应的含药血清后分别干预成骨细胞,采用细胞计数法(CCK-8)检测成骨细胞增殖活性,碱性磷酸酶染色(ALP)检测成骨细胞分化能力,实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测BMP-2、Smad5 m RNA表达,蛋白免疫印迹法检测BMP-2、Smad5蛋白表达。结果:干预12 h、24 h、48 h时,各组细胞活性逐渐增强,干预48 h后各组细胞活性均降低。干预48 h时,与空白组、阿伦磷酸钠组比较,补肾健脾活血方组细胞活性最强(P<0.05)。补肾健脾活血方组成骨细胞ALP染色最深,明显深于空白组和阿仑膦酸钠组。与空白组比较,补肾健脾活血方组BMP-2、Smad5蛋白及mRNA表达升高(P<0.05);阿仑膦酸钠组BMP-2 mRNA表达降低(P<0.05)。与阿仑膦酸钠组比较,补肾健脾活血方组BMP-2、Smad5蛋白及mRNA表达升高(P<0.05)。结论:中药复方补肾健脾活血方可以促进大鼠成骨细胞增殖分化,提高BMP-2、Smad5 mRNA和蛋白表达。