下坡跑对生长期去卵巢小鼠骨BMP-2、Smad1／5和Runx2表达的影响

目的:研究下坡跑对生长期去卵巢后骨质疏松小鼠骨形成蛋白BMP-2及其信号转导蛋白Smad1/5和靶基因Runx2基因表达的影响。方法:24只4周龄雌性C57BL/6小鼠,适应性喂养1周后随机分为安静去卵巢组(C+OVX组)、运动去卵巢组(D+OVX组)和安静假手术组(C+SHAM组)3组。D+OVX组进行8周下坡跑,训练结束后C+OVX组和D+OVX组行去卵巢手术,C+SHAM组行假手术。术后正常喂养6周处死小鼠,采用RT-PCR检测骨BMP-2、Smad1/5和Runx2 mRNA表达;采用比色法检测血液生化指标;使用Hologic Discovery A骨密度仪检测前肢骨BMD。结果:与C+OVX组相比,D+OVX组BMP-2(P<0.01)、Smad1(P<0.05)、Smad5(P<0.01)和Runx2(P<0.01)mRNA表达显著上调,磷离子浓度和BMD显著升高(P<0.05),钙离子浓度显著降低(P<0.05)。与C+SHAM组相比,D+OVX组Runx2和Smad1mRNA表达显著下调(P<0.05),ALP活性显著降低(P<0.05),磷离子浓度显著升高(P<0.05)。与C+SHAM组相比,C+OVX组BMP-2(P<0.05)、Runx2(P<0.01)和Smad5(P<0.01)mRNA表达显著下调,ALP活性(P<0.05)和BMD(P<0.01)显著降低,磷离子浓度显著升高(P<0.01)。结论:BMP-2及其信号转导蛋白Smad1/5、靶基因Runx2基因表达水平较高可能是促进骨形成的生物学机制,下坡跑上调生长期去卵巢后小鼠BMP-2、Smad1/5和Runx2基因表达,可能与早期运动训练防治骨质疏松的机制有关。

辛伐他汀对去卵巢骨质疏松大鼠骨组织BMP-2及信号转导蛋白Smad1/5表达的影响

目的:研究辛伐他汀对去卵巢(OVX)骨质疏松大鼠骨形成蛋白BMP-2及其信号转导蛋白Smad1/5表达的调节,探讨BMP-2及其信号转导蛋白Smad1/5在骨质疏松发病机制中的作用机制及辛伐他汀对其调节作用。方法:54只3个月龄雌性SD大鼠,随机分成3组,实验组、对照组、模型组,每组18只。适应性喂养1周后进行手术,术后8周开始给药,实验组给予辛伐他汀5 mg/(kg.d)灌胃,其余2组用等量生理盐水灌胃。用药后第4周每组随机处死半数大鼠,12周后处死剩余大鼠,分离胫骨,免疫组化检测胫骨干骺端BMP-2及其信号转导蛋白Smad1/5的表达。结果:①用药4周,大鼠胫骨干骺端BMP-2表达:实验组、对照组较模型组增加(P<0.05或P<0.01);②用药12周,大鼠胫骨干骺端BMP-2表达、Smad1/5表达:实验组、对照组较模型组增加(P<0.05或P<0.01);③用药12周较4周,实验组Smad1/5表达明显增加(P<0.01)。结论:BMP-2及信号转导蛋白Smad1/5表达水平的下调可能是原发性骨质疏松发生的重要机制,辛伐他汀能上调BMP-2的表达,长期用药能促进信号转导蛋白Smads1/5的表达,可能与其防治绝经后骨质疏松症的作用机制有关。

泥蚶Smad1/5基因cDNA全长克隆及时空表达特征分析

为了研究Smad1/5基因在泥蚶生长、发育过程中的调控作用,本研究利用SMART RACE方法克隆得到泥蚶Smad1/5基因(Tg-Smad1/5)的c DNA全长序列,该序列全长2 424bp,开放阅读框1 386 bp,编码462个氨基酸。Tg-Smad1/5蛋白与合浦珠母贝Smad5、太平洋牡蛎Smad5和大西洋舟螺Smad1的同源性分别达到了92.3%、91.2%和80.4%,与脊椎动物的同源性都在70%以上;该蛋白包含MH1和MH2区2个较为保守的结构域,此结构与高等动物Smad1和Smad5蛋白极为相似,表明该基因在物种进化过程中比较保守。利用qRTPCR技术,研究了Smad1/5基因在泥蚶6个组织和9个发育时期中的表达情况,结果显示,TgSmad1/5基因在泥蚶成贝6个组织中均有表达,在斧足中的表达量最高,极显著地高于其他组织;在各发育时期中,Tg-Smad1/5表达量随发育进程呈逐渐升高的趋势,在眼点幼虫期达到最高,极显著高于其他时期,而在变态至稚贝时,表达量又极显著地下降。研究结果表明,TgSmad1/5具有类似于高等动物的分子结构,并在泥蚶不同组织、不同发育时期表达有所差异,这为进一步研究该基因在贝类中的功能和作用机制奠定了重要基础。

雷奈酸锶通过骨形态发生蛋白-2/Smad通路促进骨髓间充质干细胞成骨分化

目的探讨骨形态发生蛋白-2（BMP-2）/Smad通路在雷奈酸锶（Sr）促进大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为成骨细胞过程中的作用。方法体外分离培养大鼠BMSCs,根据实验目的加入不同浓度Sr、BMP-2的拮抗剂noggin及Smad1小干扰RNA（SiRNA）。酶标法检测碱性磷酸酶（ALP）活性,茜素红染色检测钙结节,Western blotting法检测磷酸化Smad1/5/8及Runt相关转录因子-2（Runx2）蛋白的表达。结果应用0.1~10 mmol/L Sr处理BMSCs细胞1 h后,细胞内磷酸化Smad1/5/8表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h能抑制Sr对磷酸化Smad1/5/8表达的上调作用;应用0.1~5 mmol/L Sr处理细胞6 h后,细胞内Runx2表达增高,其中浓度为1 mmol/L时,表达达到高峰;在Sr处理BMSCs前,应用Smad1 SiRNA转染细胞后能下调Smad1/5/8、磷酸化Smad1/5/8的表达,并抑制Sr对Runx2表达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论 BMP-2/Smad通路参与了Sr促进BMSCs成骨分化。

LDN-193189对人去分化软骨肉瘤细胞系NDCS-1的抑制作用研究

目的:检测骨形成蛋白(BMP)受体抑制剂LDN-193189对人去分化软骨肉瘤(DDCS)细胞系NDCS-1的抑制作用,探讨LDN-193189对去分化软骨肉瘤的抑癌机制。方法:以5 nmol/L的LDN-193189作用于NDCS-1细胞,MTT、平板克隆法检测LDN-193189对NDCS-1细胞的增殖抑制作用,Transwell法、划痕实验检测LDN-193189对NDCS-1细胞的侵袭抑制作用,Western blot检测BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2的蛋白表达抑制情况。结果:药物处理后NDCS-1细胞增殖、侵袭被明显抑制;药物处理后NDCS-1细胞的BMPR2、p-Smad1/5及RUNX2蛋白表达下降。结论:LDN-193189通过抑制BMPR2-p-Smad1/5-RUNX2信号传导通路能有效抑制去分化软骨肉瘤细胞系NDCS-1的增殖侵袭能力。

骨形态发生蛋白2表达载体的构建及生物学功能鉴定

目的:从真核细胞中获得骨形态发生蛋白2(BMP2)编码基因,构建其真核表达载体并进行鉴定。方法:提取人HeLa细胞总RNA,经反转录后用特异性引物扩增BMP2编码区,连接至pcDNA3.1载体,筛选阳性克隆并进行功能学鉴定。结果:反转录PCR获得1100 bp的片段,经分子克隆后鉴定序列与BMP2一致,并且在真核细胞中能够诱导Smad1/5/8的磷酸化。结论:构建了真核表达载体pcDNA3.1-BMP2并验证了其体内功能,为后续探讨BMP2在骨发育中的作用机制打下基础。

益气化瘀法干预TGF-β/ALK1/Smad1/5通路对糖尿病大鼠肉芽增生期创面血管生成的影响

目的:观察益气化瘀中药对糖尿病大鼠肉芽增生期创面转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)/激活素受体样激酶(actilin receptor-like kinase 1,ALK1)/Smad1/5通路及血管新生的影响。方法:将50只大鼠随机分为益气化瘀组、益气组、化瘀组、模型组、正常对照组。通过腹腔注射链脲佐菌素和外科方法建立糖尿病大鼠全层皮肤缺损模型,运用Westernblot技术手段检测各组肉芽增生期创面成纤维细胞ALK1/Smad1/5的表达水平及微血管计数。结果:糖尿病模型组微血管计数为(35.38±11.45),明显低于正常组(69.13±28.45)(P<0.05);ALK1(3 635.86±2 135.83)/Smad1(2 729.92±1 757.01)/Smad 5(2 570.81±1 188.04)均明显低于正常组(P<0.01)。益气化瘀组及其拆方组能不同程度的上调ALK1/Smad1/5通路,促进血管新生,且益气化瘀组更优于其拆方组。结论:糖尿病创面难以愈合的机制可能与ALK1/Smad1/5通路有关,益气化瘀中药可能通过干预ALK1/Smad1/5通路,促进血管新生,从而加速创面愈合。

外源性细胞色素C对脓毒症小鼠心肌TGF-β1和Smad1/5/8影响的实验研究

目的探讨外源性细胞色素c(Cytc)对脓毒症小鼠心肌TGF-β1和Smad1/5/8的作用及影响。方法雄性昆明小鼠78只,随机分为假手术组(Sham)、脓毒症组(CLP)、细胞色素C处理组(T)。CLP组和T组用盲肠结扎穿孔法造模,Sham组仅开腹翻动盲肠。24 h造模成功后,T组经尾静脉注射外源性Cytc(20mg/kg)、Sham组和CLP组分别经尾静脉注射150(1生理盐水。30 min后以0、6 h、12 h点取材,每个时间点5只小鼠,测左心室收缩压(LV S1P)、左心室舒张末期压(LVEDP)、左室内压力变化最大上升和下降速率(LV±dp/dt-max);取心肌组织分别做组织学检查、RT-PCR和Western-Blot检测TGF-β1和Smad1/5/8蛋白的表达;24h点留取电镜标本,余下的小鼠观察生存率。结果与CLP组比较,T组一般情况好转,生存率提高,病理学改善;LVSP、LVEDP和LV±dp/dt-max提高(P<0.05);各组TGF-β1和Smad1/5/8蛋白均有表达,CLP组表达明显增加,经外源性Cytc干预后蛋白表达减少,CLP组与其它组比较差别有统计学意义(P<0.05)。结论外源性Cytc逆转脓毒症小鼠心肌线粒体功能抑制和心肌抑制,改善心功能。