FLIP干扰性小RNA促进大肠癌细胞的凋亡

目的:研究对应FLIP基因的siRNA片段对大肠癌细胞株HT-29凋亡的影响,明确FLIP在Fas介导的凋亡途径中的作用. 方法:体外培养大肠癌细胞HT-29,通过电穿孔技术将特异性siRNA片段转染入细胞,半定量RT-PCR 法判断干扰前后FLIP mRNA水平的变化,分析RNA 干扰的特异性、时效性,并比较对应不同位点的两个siRNA片段对FLIP的干扰效果.经凋亡诱导型抗体激活后,以Annexin V染色法及DNA降解片段检测分析干扰前后HT-29细胞对Fas介导的凋亡敏感性的改变. 结果:特异性siRNA片段能有效降低FLIP mRNA水平,最大干扰效率达65.02%,明显高于作为对照的非相关片段;干扰作用于转染后24 h即可出现,48 h达高峰,72 h稍有降低;对应不同位点的两个siRNA片段对FLIP均可产生干扰作用,彼此间差别不大.在诱导型抗体的刺激下,与未转染细胞相比,转染siRNA 的HT-29细胞中凋亡细胞所占比例明显增加. 结论:特异性siRNA片段可显著降低FLIP基因mRNA 的表达水平,并提高HT-29细胞对Fas介导的凋亡敏感性.以FLIP为靶点的RNA干扰技术可望成为大肠癌基因治疗的新方法.

靶向抑制人SREBP-1基因对高糖刺激下人肾小管上皮细胞脂滴形成的影响

目的构建人SREBP-1基因的shRNA载体并转染人肾小管上皮细胞(HKC)明确是否沉默SREBP-1基因的表达可减轻高糖环境引起的细胞内脂滴形成。方法设计两对针对人SREBP-1基因的干扰靶序列及短链寡核苷酸和线性化的pGenesil-1质粒进行连接,筛选鉴定并最终命名为pGenesil-1-SREBP1-1和pGenesil-1-SREBP1-2。体外培养人肾小管上皮细胞并随机分组,采用阳离子脂质体法转染细胞后给予高糖刺激48h,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达,半定量RT-PCR和Westernblot分析目标基因表达丰度的变化,并采用油红O染色检测细胞内脂滴。结果经酶切及测序鉴定证明构建的重组载体pGenesil-1-SREBP1-1、pGenesil-1-SREBP1-2序列正确;转染HKC细胞后均可表达绿色荧光;RT-PCR和Westernblot显示pGenesil-1-SREBP1-1、pGenesil-1-SREBP1-2能够有效抑制高糖环境下HKC细胞SREBP-1的表达,与阴性质粒对照组相比,差异有统计学意义。进一步研究发现在HKC细胞内,SREBP-1基因表达沉默明显抑制了脂肪酸合成酶(FAS)的转录,细胞内脂滴明显减少。结论有效沉默高糖刺激下HKC细胞SREBP-1的基因表达可通过抑制FAS转录而减少细胞内脂滴形成。

靶向小干扰RNA对小鼠肺缺血／再灌注损伤时细胞凋亡及CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白的作用

目的观察靶向小干扰RNA（siRNA）对小鼠肺缺血／再灌注损伤（PIRI）时细胞凋亡及CCAAT／增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）的影响。方法荧光标记法观察靶向siRNA在小鼠体内的分布并评估转染效率。C57BL／6J小鼠50只，随机分为5组（n=10）：假手术组（Sham组）、缺血／再灌注组（I／R组）、I／R＋载体组（I／R＋Vehicle组）、I／R＋阴性对照组（I／R＋Control—siRNA组）和IVR＋CHOP．siRNA组（I／R＋CHOP—siRNA组）。取左肺，检测肺湿／干重比（W／D）、总肺水含量（TLW）和肺泡损伤定量评估（]QA），光镜和电镜观察肺组织结构改变，逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）、Westernblot检测CHOP、葡萄糖调节蛋白78（GR-VT8）mRNA和蛋白表达水平，原位末端转移酶标记（TUNEL）法检测细胞凋亡指数（AI）。结果靶向siRNA通过滴鼻法可有效分布于肺脏中。与Sham组比较，L／R组中CHOP、GRP78mRNA和蛋白表达水平（0．80±．03、0．80±0．02；0．80±0．04、0．84±0．02）均升高（P〈0．05），W／D（5．24±0．49）、TLW（4．24±0．49）、IQA[（42．80±4．21）％]和AI[（34．50±1．51）％]均明显增加（P〈0．01）；肺组织形态结构发生明显损伤；与I／R＋Vehicle组和L／R＋Contr01．siRNA组比较，I／R＋CHOP-siRNA组中GRP78mRNA和蛋白表达水平（0．84±0．04、0．85±0．04）无明显变化（P〉0．05），而CHOPmRNA和蛋白表达水平（0．40±0．03、0．44±0．04）均降低（P〈0．05），W／D（2．54±0．24）、TLW（1．54±0．24）、IQA[（16．71±2．33）％]和AI[（11．50±1．58）％]亦均降低（P〈0．01）；肺组织形态结构损伤减轻。结论靶向siRNA对I／R损伤肺具有良好的保护作用，其机制可能与其对抗过度的未折叠蛋白反应（UPR）中CHOP介导的细胞凋亡有关。