去泛素化酶USP10通过稳定Smurf1抑制TGF-β/BMP信号通路

目的 探究生理条件下去泛素化酶USP10调控的关键信号通路及分子机制。方法 利用GEO2R和Metascape对Usp10+/+和Usp10-/-新生小鼠肾组织基因芯片(GSE198574)差异表达基因和通路富集分析,使用免疫印迹实验和免疫组化技术检验核心转录因子的表达情况;进一步利用免疫印迹检测该信号通路,并通过基因芯片和免疫组化分析候选分子的表达情况;使用免疫共沉淀(Co-IP)和GST-pull down实验验证USP10与候选分子的相互作用,通过泛素化实验明确USP10对底物分子的调控机制;利用免疫印迹检测细胞增殖、凋亡相关蛋白p21、Cleaved-caspase 3的表达情况,使用CCK-8和克隆形成实验分析USP10对细胞增殖的影响。结果 Usp10-/-新生小鼠肾组织中TGF-β/BMP通路激活,USP10在小鼠体内缺失后导致Smad泛素相关因子1 (Smurf1)蛋白质水平降低,Smad1/5蛋白质水平上调,却不影响它们的转录水平;机制上,USP10与Smurf1存在相互作用,并依赖其去泛素化酶活性去除Smurf1多聚泛素化。Usp10敲除后促进细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白p21表达上调,并抑制细胞的增殖能力。结论 USP10通过去泛素化并稳定Smurf1,抑制TGF-β/BMP信号通路,从而维持小鼠组织器官和细胞增殖稳态。

脂溢性角化病皮损区Smurf1和Smurf2表达增强

目的探讨脂溢性角化病皮损区Smad泛素化调节因子1和2(Smad ubiquitination regulatory factor1 and 2,Smurf1,2)的表达及其意义。方法采用实时定量聚合酶链式反应(quantitative Real-time PCR,RT-PCR)和免疫组织化学技术分别检测脂溢性角化病皮损和对照正常皮肤中Smurf1和2的表达情况。结果与对照正常皮肤相比,脂溢性角化病皮损中Smurf1和2表达水平上调。结论脂溢性角化病皮损中Smurf1和2的过度表达可干扰转化生长因子β(transfor-ming growth factor-β,TGF-β)信号转导通路,可能使TGF-β抑制上皮增生的作用不能有效发挥,促进了脂溢性角化病表皮的过度增生。

补肾填精中药对骨质疏松症模型大鼠股骨中Smurf1信号转导蛋白表达影响的实验研究

目的通过观察去卵巢骨质疏松症模型大鼠股骨中Smurf1的表达变化,探索骨质疏松症的发病机理。方法实验采用切除大鼠双侧卵巢的方法复制骨质疏松症模型,同时应用补肾填精作用的纳米钙补肾填精中药低、高剂量组,对模型大鼠给药干预12周,用骨疏康颗粒剂、盖天力作为阳性对照组,以及正常对照组、假手术对照组和模型空白组,并与补脾中药补中益气汤作比较;免疫组化SABC法检测股骨中的Smurf1蛋白活性表达。结果与正常组相比较,模空组Smurf1阳性表达显著下降,P<0.01;用药12周后,与模空组相比较,各用药组均可上调其表达情况,P<0.01。结论骨组织中Smurf1阳性表达降低可能是骨质疏松症发生的机制之一,补肾填精中药可能通过改善和调控股骨中Smurf1的表达,而起到防治骨质疏松症的作用。

Smurf1调节因子在骨形态发生蛋白诱导骨生成中的作用

骨形态发生蛋白(BMP)是明确具有诱导成骨作用的生长因子。其通过结合靶细胞表面受体,活化细胞内一系列Sm ad蛋白,经Sm ad蛋白介导,将信号转导至细胞核内,在一系列辅助因子的作用下,启动成骨基因的表达。细胞内源性Smurf1对这一整个过程起抑制作用。本文就Smurf1调节因子在骨形态发生蛋白诱导骨生成中的作用做一综述。

皮肤基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中Smad 7、Smurf 1和Smurf 2的表达

目的探讨Smad 7、Smurf 1和Smurf 2在基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中表达水平的变化及其意义。方法采用实时定量聚合酶链反应和免疫组化技术分别检测基底细胞癌、鳞状细胞癌及正常人对照皮肤中Smad 7、Smurf 1和Smurf 2的表达。结果Smad 7、Smurf 1和Smurf 2在基底细胞癌和鳞状细胞癌中的表达较正常表皮显著升高。结论基底细胞癌和鳞状细胞癌皮损中Smad 7、Smurf 1和Smurf 2的表达增强可能干扰转化生长因子β(TGFβ)信号转导通路的多个环节,使TGFβ抑制上皮增生的作用不能有效发挥,从而有助于上述表皮肿瘤的异常增殖。

SMURF1、RUNX3在甲状腺乳头状癌组织中的表达及其临床意义

目的探讨SMURF1、RUNX3蛋白在甲状腺乳头状癌(PTC)中的表达及其与患者临床病理特征的相关性。方法采用免疫组化SP法检测60例PTC组织及20例正常甲状腺组织中SMURF1、RUNX3蛋白的表达,分析两者在PTC与正常甲状腺组织中的表达差异及其与PTC患者临床病理特征的相关性。结果 PTC组织中SMURF1蛋白阳性表达率高于正常甲状腺组织,而RUNX3阳性表达率低于正常甲状腺组织(均P<0.01);SMURF1、RUNX3蛋白的表达与PTC患者的TNM分期、病理分级及淋巴结转移均相关(均P<0.05),而与患者性别、年龄及肿瘤大小等因素均无关(均P>0.05)。PTC组织中SMURE1的蛋白表达与RUNX3蛋白表达呈负相关(r=-0.564,P<0.05)。结论 SMURF1、RUNX3蛋白在PTC组织中表达异常,并呈负相关,提示两者可能相互作用,共同促进PTC发生、发展,两者可作为PTC分类和分期的辅助指标。

SMURF1蛋白在人胃癌组织中的表达及其临床意义

目的:研究SMAD泛素化调节因子1(SMURF1)蛋白在人胃癌组织中的表达及临床意义。方法:采用免疫组化SP法检测68例胃癌及对应癌旁组织中SMURF1蛋白表达情况,分析SMURF1蛋白表达与胃癌不同临床病理特征的相关性。结果:SMURF1蛋白在胃癌组织中的阳性率为76.5%(52/68),而在对应癌旁组织中的阳性率仅为26.5%(18/68),差异具有统计学意义(χ2=34.029,P=0.000)。胃癌组织中SMURF1蛋白表达与浸润深度(χ2=5.461,P=0.019)、淋巴结转移(χ2=9.141,P=0.002)和肿瘤分期(χ2=8.380,P=0.004)显著相关,而与性别、年龄和肿瘤大小无明显相关。结论:胃癌组织中SMURF1蛋白异常高表达,其高表达与胃癌侵袭转移密切相关,提示SMURF1在胃癌发生、发展中可能发挥重要作用。

miRNA-125a靶向调控SMURF1对结肠癌生物学行为的影响

目的探讨miRNA-125a通过对靶基因SMURF1的调控在结肠癌中的影响。方法 qRT-PCR检测结肠癌患者血清中miRNA-125a和SMURF1表达水平并分析其与结肠癌相关临床指标的相关性;microRNA靶基因数据库预测miRNA-125a靶基因SMURF1并使用荧光素酶报告基因法验证其结合;qRTPCR和Western blot检测miRNA-125a模拟物对SMURF1mRNA及蛋白表达的影响;HE染色检测结肠癌组织中SMURF1的表达;CCK-8法、细胞划痕实验及流式细胞法检测miRNA-125a模拟物和SMURF1对SW480细胞增殖、迁移及周期的影响;构建结肠癌肿瘤异种移植小鼠模型,采用称重及PCNA染色检测miRNA-125a模拟物对小鼠体内肿瘤生长的影响。结果结肠癌患者血清中miRNA-125a表达水平与结肠癌相关临床指标呈负相关性,SMURF1表达水平与结肠癌相关临床指标呈正相关性。结肠癌组织中miRNA-125a的表达水平显著降低,miRNA-125a模拟物可抑制SMURF1的mRNA翻译及蛋白水平。结肠癌肿瘤组织中SMURF1表达水平明显升高,miRNA-125a模拟物可以抑制SW480细胞的增殖、迁移和S期细胞周期的聚集,然而这种抑制效果会因SMURF1表达升高而减弱。miRNA-125a模拟物抑制小鼠体内结肠癌生长及SMURF1的表达。结论 miRNA-125a通过下调SMURF1的表达在结肠癌的发展过程中发挥抑制作用,具有成为结肠癌诊断及治疗靶点的潜力。

Smurf1基因靶向RNAi慢病毒载体的构建及转染

目的构建Smad泛素调节因子1(Smurf1)基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒表达载体,观察其转染骨肉瘤U20S细胞后对Smurf1基因表达的抑制作用,为后续研究奠定基础。方法构建Smurf1基因过表达质粒,同时针对Smurf1基因序列设计合成4条RNAi片段并构建RNAi慢病毒载体。过表达质粒和RNAi质粒共转染293T细胞后应用Western印迹法进行外源筛靶,筛靶出成功的干扰质粒PSC2939。用慢病毒包装PSC2939后感染U20S细胞,进行内源验证,荧光定量PCR和Western印迹检测U20S细胞中Smurf1mRNA及蛋白的表达。结果经PCR及测序证实,Smurf1基因过表达载体及4种干扰载体均成功构建;Western印迹外源筛靶显示,PSC2939干扰载体能有效敲减目的基因的表达;慢病毒包装后的PSC2939干扰载体能有效抑制U20S细胞中Smurf1蛋白的表达,对Smurf1mRNA的抑制率达到60%以上。结论成功构建可供感染的Smurf1基因RNAi慢病毒载体,为进一步研究Smurf1基因在骨肉瘤细胞中的作用提供了有效的实验工具。

慢病毒介导稳定敲低Smurf1细胞株的构建及对细胞迁移的影响

目的构建慢病毒介导稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株并检测敲低Smurf1细胞迁移的影响。方法将包装好的Smurf1敲低慢病毒感染HeLa和A549细胞,7 d后进行嘌呤霉素抗性筛选阳性细胞,Western blot和qPCR检测敲低效果,并进行Transwell检测Smurf1敲低对细胞迁移的影响。结果利用干扰慢病毒系统成功构建稳定敲低Smurf1的HeLa和A549细胞株,稳定敲低Smurf1抑制细胞的迁移速率。结论敲低Smurf1抑制细胞迁移。

miR-367-3p靶向SMURF1抑制BCG介导的巨噬细胞凋亡和自噬

目的:本研究旨在探讨miR-367-3p对BCG介导的细胞凋亡和自噬途径的调控的影响及其可能的作用机制。方法:采用卡介苗菌株BCG感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,RT-PCR检测miR-367-3p与SMURF1mRNA的表达;Westernblot检测SMURF1、凋亡相关蛋白及自噬相关蛋白表达水平;菌落形成单位(CFU)计数检测BCG生存率;运用ELISA技术检测巨噬细胞凋亡率;双荧光素酶报告系统、RT-PCR及Westernblot法验证miR-367-3p与SMURF1之间的靶向调控关系。结果:BCG感染诱导巨噬细胞RAW246.7中miR-367-3p高表达,并呈时间依赖性。此外,下调miR-367-3p明显降低BCG感染的巨噬细胞的存活率,并促进巨噬细胞凋亡,同时下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达且上调促凋亡蛋白Bax的表达水平。另外,抑制miR-367-3p表达明显增加巨噬细胞中LC3-Ⅱ表达水平,同时降低p62的表达量,从而加强细胞的自噬水平。生物信息学分析显示SMURF1是miR-367-3p的靶基因。双荧光素酶报告系统、RT-PCR及Westernblot结果证实miR-367-3p可靶向作用于SMURF1-3′-UTR并负调控其表达。结论:下调miR-367-3p通过靶向调控SMURF1可促进巨噬细胞凋亡和自噬进程,进而介导了BCG的免疫逃逸从而抑制胞内BCG的生存,提示miR-367-3p有望成为结核感染的诊断标志物和治疗性疫苗的靶标,可为结核病的基因诊断和治疗提供参考。

初诊系统性红斑狼疮患者血清Smad特异性E3泛素蛋白连接酶1及Smad1水平分析

目的通过观察初诊系统性红斑狼疮(SLE)患者血清Smad特异性E3泛素蛋白连接酶1(Smurf1)及Smad1的水平变化,初步探讨Smad1、Smurf1与SLE发生发展的关系。方法选择初诊SLE患者36例纳入病例组,健康体检者36例纳入对照组。采用ELISA法检测两组血清Smurf1、Smad1。分析病例组血清Smurf1、Smad1水平与炎症相关指标[C反应蛋白(CRP)、白细胞介素(IL)6、红细胞沉降率(ESR)]、血常规指标(WBC、Hb、PLT)、肾功能指标(血肌酐、尿素氮)、免疫功能指标(补体C3、C4和免疫球蛋白IgG、IgA、IgM)、自身抗体指标(抗核抗体、抗dsDNA抗体、抗Sm抗体、抗SSA、抗SSB)及疾病活动指数(SLEDAI)的相关性。结果病例组血清Smurf1、Smad1水平高于对照组(P均<0.05)。病例组血清Smurf1、Smad1与SLEDAI评分、CRP、IL-6、ESR、WBC、Hb、血肌酐、尿素氮、补体C4、IgG、IgA、IgM均无相关性,血清Smurf1与补体C3、PLT呈负相关(r分别为-0.529、-0.625,P均<0.05),与血清Smad1呈正相关(r=0.719,P<0.05);血清Smad1与PLT呈负相关(r=-0.673,P<0.05)。血液系统受累的SLE患者血清Smurf1水平高于无血液系统受累者(P<0.05)。结论初诊SLE患者血清Smurf1、Smad1异常增高,与PLT、补体水平相关;Smurf1、Smad1可能参与了SLE的发生发展过程,Smurf1、Smad1水平增高可能有助于预测SLE患者血液系统受累。

Smurf1通过抑制LKB1的多聚泛素化而调控其蛋白稳定性

目的:为了探寻肝脏激酶B1(liver kinase B1,LKB1)的上游调控分子,并研究其对LKB1的影响。方法:首先,利用UbiBrowser数据库预测LKB1可能的上游调控分子,并根据评分筛选出可能对LKB1具有调控作用的Smurf1基因。然后,构建Smurf1和LKB1相关过表达质粒,并转染HEK293T细胞,通过Western blot检测LKB1蛋白质表达的变化。最后,运用荧光定量PCR(qPCR)、免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)探索Smurf1调控LKB1可能的分子机制。结果:①成功构建LKB1和Smurf1相关过表达质粒。②在HEK293T细胞中过表达0、0.5、1、2μg的野生型Smurf1时其对应的LKB1蛋白相对表达量分别为0.0262±0.0007、0.0727±0.0003、0.1301±0.0013、0.4315±0.0010。经单因素方差分析,其结果为F=79636.433,P=0.000。与0μg对照组相比,进一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各组P值分别为0.000、0.000和0.000。③在HEK293T细胞中过表达0、0.5、1、2μg的突变型Smurf1时其对应的LKB1的蛋白相对表达量分别为0.0180±0.0001、0.0530±0.0004、0.1250±0.0010、0.2004±0.0017。经单因素方差分析,其结果为F=12887.993,P=0.000。与0μg对照组相比,进一步采用LSD-t法分析,0.5、1、2μg各组P值分别为0.000、0.000和0.000。④以GAPDH为内参,未过表达Smurf1组和过表达Smurf1组中,LKB1的相对mRNA表达水平分别为1.0851±0.4125、2.3982±1.7669。经独立样本t检验统计分析,P=0.257。⑤以β-actin为内参,未经Smurf1处理组、野生型Smurf1(WT)处理组、突变型Smurf1(C699A)处理组中LKB1的相对泛素化水平分别为1.8238±0.0278、0.0881±0.0051、0.2127±0.0062。经单因素方差分析,其结果为F=6721.953,P=0.000。与未经Smurf1处理组相比,进一步采用LSD-t法分析,野生型Smurf1组和突变型Smurf1组各组P值分别为0.000和0.000。结论:这些结果表明Smurf1通过降低LKB1的多聚泛素化从而参与其蛋白稳定性的调节。

补肾活血方对骨质疏松症大鼠Smurf1信号转导蛋白的影响

目的通过观察摘除卵巢所致骨质疏松症模型中肾脏组织的Smurf1蛋白表达量的变化,研究补肾活血方治疗骨质疏松症的作用机制。方法采用切除雌性大鼠双侧卵巢的方法制备骨质疏松症的模型,应用补肾活血方干预模型大鼠,以戊酸雌二醇作为阳性对照组,以正常大鼠及假手术组作为标准的对照组,观察各组大鼠肾脏组织中的Smurf1 mRNA和蛋白表达变化。结果空白模型组中Smurf1 mRNA及蛋白的表达较空白组和假手术组显著降低(P<0.01);治疗12周后,各用药组Smurf1 mRNA及蛋白表达均较空白模型组显著上调(P<0.01)。结论补肾活血方可能通过调控雌性大鼠中Smurf1 mRNA及蛋白的表达,对骨质疏松症起到防治的作用。

lncRNA KCNQ1OT1在结肠癌细胞中的促癌功能和下游调控通路研究

目的明确lncRNA KCNQ1OT1在结肠癌HCT-116和HT-29细胞中的功能,探讨其作用的分子机制。方法在结肠癌HCT-116和HT-29细胞系中转染KCNQ1OT1的过表达质粒及空白对照,siRNA干扰KCNQ1OT1及空白对照;分别在两个细胞系中进行CCK8、划痕实验、Transwell、细胞侵袭实验以验证KCNQ1OT1对细胞功能的影响;免疫共沉淀(RNA immune precipitation,RIP)和双荧光素酶标记实验分别验证KCNQ1OT1与miR-125a-5p的特异结合以及miR-125a-5p和SMURF1蛋白的特异结合。过表达和敲低KCNQ1OT1、miR-125a-5p后,Western hlot验证SMURF1的表达;完成过表达KCNQ1OT1同时过表达miR-125a-5p、敲低KCNQ1OT1同时敲低miR-125a-5p后检测SMURF1表达情况的Resecue实验,验证KCNQ1OT1与miR-125a-5p的调控关系。结果在结肠癌HCT-116和HT-29细胞中,过表达的KCNQ1OT1能促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭;KCNQ1OT1敲低后,结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭受抑制;miR-125a-5p与KCNQ1OT1及SMURF1均能特异性结合;过表达KCNQ1OT1促进SMURF1的表达,敲低KCNQ1OT1抑制SMURF1的表达;过表达miR-125a-5p抑制SMURF1的表达,敲低miR-125a-5p促进SMURF1的表达;过表达KCNQ1OT1的基础上同时表达miR-125a-5p能显著抑制SMURF1的表达,敲低KCNQ1OT1的基础上同时敲低miR-125a-5p能促进SMURF1的表达。结论在结肠癌细胞中,lncRNA KCNQ1OT1通过KCNQ1OT1-miR-125a-5p-SMURF1调控轴,促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

Smurf2单克隆抗体的制备与鉴定

Smad泛素调节因子家族的两个E3泛素连接酶成员Smurf1和Smurf2(Smad ubiquitin regulatory factor 1and 2)具有至少80%的同源性.为了更好地研究它们的功能,需要获得一个能区分Smurf1和Smurf2的单克隆抗体.选取Smurf2与Smurf1蛋白序列中仅有的非同源区域序列作为抗原免疫Bal b/C小鼠,成功制备若干株能稳定分泌抗Smurf2抗体的杂交瘤细胞株.对所获得的单克隆抗体的效价和特异性等进行一系列检测,结果表明该抗体能特异性地识别过表达及细胞内源Smurf2蛋白.此外该抗体能被应用于Western blot和免疫荧光实验,从而为深入研究Smurf2的细胞生物学功能提供了良好的实验基础.

miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞成牙本质分化的影响及信号通路调控机制

目的:探讨miR-20a-3p基因干扰对人牙髓干细胞(hDPSCs)成牙本质分化的影响及信号通路调控机制。方法:对hDPSCs转染miR-20a-3p-mimic和miR-20a-3p-inhibitor来上调或下调其表达,然后对hDPSCs进行成牙本质分化诱导培养。通过茜素红染色观察细胞钙基质的矿化程度并检测ALP活性。通过双荧光素酶报告基因测定实验验证miR-20a-3p与mothers against decapentaplegic homolog(SMAD)特异性E3泛素蛋白连接酶1(SMURF1)的靶向调节关系。通过RT-qPCR检测hDPSCs中miR-20a-3p以及SMURF1、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨钙蛋白(OCN)和牙本质涎磷蛋白(DSPP)mRNA水平。结果:与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的茜素红相对染色强度升高了67.09%,miR-20a-3p-inhibitor组降低了46.13%(P<0.05)。与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的相对ALP活性升高了52.89%,miR-20a-3p-inhibitor组降低了53.32%(P<0.05)。与Control组相比,miR-20a-3p-mimic组的RUNX2、OCN和DSPP mRNA相对表达量分别升高了2.19倍、1.86倍和2.35倍,miR-20a-3p-inhibitor组分别降低了63.26%、58.84%和68.12%(P<0.05)。双荧光素酶报告基因测定显示miR-20a-3p靶向抑制SMURF1(P<0.05)。过表达SMURF1抑制了miR-20a-3p对成牙本质分化的影响(P<0.05)。结论:miR-20a-3p通过靶向抑制SMURF1及其下游基因促进hDPSCs的成牙本质分化。

hMSC成骨分化相关lncRNA的筛选和初步鉴定

【目的】筛选和初步鉴定人骨髓间充质干细胞(hMSC)成骨分化相关的长链非编码RNA(lncRNA)。【方法】利用Refseq,UCSC knowngenes,Ensembl,H-invDB 7.0,RNAdb 2.0,NRED生物软件分析成骨基因相关的lncRNA,综合获得可能的成骨相关lncRNA;3例骨髓标本来源于行腰椎手术患者,密度梯度法分离扩增hMSC后,分成骨诱导组和对照组,地塞米松、维生素C、β-甘油磷酸钠诱导hMSC成骨分化,通过ALP测定及钙结节茜素红染色进行成骨诱导鉴定;qRT-PCR验证hMSC成骨分化前、后差异表达的lncRNA,以及成骨分化前、后差异表达的基因BMP1、MSX1、Runx2、Smurf-1、ALP。【结果】通过上述生物软件综合分析发现3个成骨基因MSX1、BMP1和Smurf1周围存在相关lncRNA。4个lncRNA(AK129811、AK024937、AK096529、uc003ups)与成骨基因Smurf-1相关;2个lncRNA(AF289591和uc003xbe)与成骨基因BMP1相关;1个lncRNA(AK056311)与成骨基因MSX1相关。ALP检测示:与对照组细胞相比,成骨诱导组细胞1周ALP值最高,达到(16.82±1.64)nmol/min,随着诱导时间的延长,ALP值逐渐降低,3周降至(8.37±1.01)nmol/min。钙结节染色显示hMSC成骨诱导分化2周后胞外开始出现少量钙结节,随着诱导时间延长钙结节数量逐渐增加,成骨诱导至第3周钙结节最多,定量测定钙质量浓度达(716±49)mg/mL。RT-qPCR结果显示绝大部分lncRNA在hMSC成骨分化过程中表达均下调,其中2个与Smurf-1相关lncRNA(AK096529和uc003ups)与成骨诱导前相比,存在显著性下调。1个与MSX1相关的lncRNA(AK056311)与成骨诱导前相比,也存在显著性下调。同时,成骨分化基因Runx2、ALP表达显著性上调,MSX1、Smurf-1表达显著性下调。【结论】结合既往研究结果分析:AK096529和uc003ups可能通过正向调控Smurf1,促使Smurf1下调,减少Runx2的降解,继而促进hMSC的成骨分化。

去卵巢骨质疏松症模型大鼠股骨、肾、下丘脑中Smurf1信号转导蛋白的活性变化研究

目的:观察去卵巢骨质疏松症(OP)模型大鼠股骨、肾、下丘脑中Smurf1在细胞中的定位和活性变化,探讨肾虚OP病机的分子生物学机制。方法:实验采用切除雌性大鼠双侧卵巢的方法复制肾虚OP模型,同时应用纳米钙补肾中药低、高剂量,对模型大鼠灌胃干预12周,用骨疏康颗粒剂、盖天力、补中益气汤干预模型大鼠作为阳性对照组,以及正常组、假手术对照组和模型组;免疫组化SABC法检测股骨、肾、下丘脑中的Smurf1蛋白活性表达。结果:Smurf1在股骨中的表达结果:与正常组比较,模型组表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,各用药组可上调其表达,其中补肾中药低、高剂量组、补中益气汤组有显著差异(P<0.01)。在肾中表达的结果:与正常组比较,模型组表达显著下降(P<0.01);与模型组比较,各用药组均可上调其表达情况(P<0.01)。在下丘脑中的表达结果:与正常组比较,模型组表达显著升高(P<0.01);与模型组比较,各用药组均可下调其表达情况(P<0.01)。结论:肾虚OP模型大鼠股骨、肾中Smurf1的表达降低,下丘脑中表达水平升高,可能是肾虚OP发生的机制之一。纳米钙补肾中药可能通过改善和调控股骨、肾、下丘脑中Smurf1表达,而起到防治原发性OP的作用。

泛素连接酶Smurf1促进Smurf2的Nedd化修饰

目的探讨泛素连接酶Smad泛素化相关因子2(Smad ubiquitination-related factor 2,Smurf2)Nedd化修饰的机制。方法梯度过表达Nedd8检测Smuff2的蛋白水平变化,免疫共沉淀(IP)和Western印迹分析Smurf2的Nedd化修饰,GST融合蛋白沉降技术(GST-pulldown)验证相互作用,分析Smurf1 C426A基因敲入(knock in)小鼠体内Smurf2在淋巴、脾、肝和肺组织的蛋白表达水平。结果 Smurf2可发生Nedd化修饰,过表达Nedd8可导致Smurf2蛋白水平下调,Smurf1和Smurf2能相互作用,且Smurf1可使Smurf2的Nedd化修饰增强。在Smurf1 C426A基因敲入小鼠的组织细胞中Smurf2蛋白水平上调。结论 Smurf1能促进Smurf2的Nedd化修饰。