生殖细胞特异性基因SOHLH1与SOHLH2的研究进展

SOHLH1与SOHLH2属于基础型螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,具有生殖细胞的特异性,在生殖细胞分化及发育早期发挥着重要作用。本文就SOHLH1与SOHLH2的进化、表达及调控机制进行综述,为未来人类生殖相关疾病的研究及治疗提供理论基础。

水牛Sohlh2基因的克隆分析及其表达

为阐明广西沼泽型水牛Sohlh2基因在水牛不同组织中的表达规律,根据Gen Bank已公布的牛Sohlh2基因序列,设计其编码区(CDS)扩增引物,应用RT-PCR方法扩增克隆获得目的基因片段;应用生物信息学方法,系统分析了水牛Sohlh2的遗传进化以及蛋白质的理化性质、二级和三级结构;并应用RT-QPCR技术对Sohlh2基因在水牛组织(器官)的表达进行了分析。结果表明:水牛Sohlh2基因编码区全长1 281 bp,共编码426个氨基酸。多重序列比较分析结果显示水牛Sohlh2核苷酸序列与牛、绵羊、山羊、猪、马、人和小鼠相应序列的相似性分别为98%、96%、96%、85%、86%、81%和72%,系统进化树显示Sohlh2基因在不同物种以及进化的过程中具有高度保守性。Sohlh2蛋白质呈弱碱性,无信号肽,在细胞中亚定位于细胞核中,存在b HLH结构。水牛Sohlh2基因在水牛垂体、大脑、肝脏、骨骼、卵巢和睾丸等11个组织(器官)细胞中具有不同程度的表达,其中睾丸细胞中表达量最高,垂体和生殖脊细胞中表达量次之,卵丘细胞中表达量低,心脏、肺脏、肌肉细胞和颗粒细胞中不表达。

猪生殖细胞特异性基因Sohlh1及启动子的研究

【目的】探究猪生殖细胞特异性基因在幼年和成年各组织中的表达情况,分子遗传进化特点,及其启动子的核心区域和特异性调控区间.【方法】通过RT-PCR验证猪不同时期不同组织基因的表达情况,通过生物软件分析其分子遗传进化特点,构建启动子验证载体,通过双荧光素酶分析基因启动子的核心区域和特异性调控区间.【结果】基因在仔猪与成年猪睾丸和仔猪卵巢中都有表达,在成年猪卵巢不表达;通过多个物种进化分析基因随着脊椎动物从低等到高等的演变也在进化;通过双荧光素酶分析构建的启动子验证载体,猪Sohlh1基因的启动子的核心区域在78bp附近,特异性调控区间在771-2981bp之间.【结论】基于基因的进化分析,作为试验动物模型,猪可能更优于啮齿类动物,其组织特异性表达可能主要通过其启动子特异性调控区间调控.

小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1调控Sox30基因表达的机制

目的SOHLH1(Spermatogenesis-and oogenesis-specific bHLH transcription factor-1)和SOX30(SRY box)是与精子发生相关的转录因子,Sohlh1与Sox30的基因敲除雄鼠均丧失生育能力。出生后7天Sohlh1基因敲除雄鼠DNA芯片显示Sox30表达显著下调,本文探究了早期发育相关转录因子SOHLH1对精子发生后期的关键基因Sox30基因的转录调控作用。方法构建Sox30启动子荧光素酶表达质粒,瞬时共同转染Sox30荧光素酶表达质粒和Sohlh1真核表达质粒并利用荧光素酶活性测定实验检测荧光值。通过染色质免疫共沉淀实验检测SOHLH1与Sox30启动子DNA序列特异序列的结合情况筛选主要激活位点。结果共转染Sohlh1真核表达质粒和Sox30启动子区域荧光素酶质粒的实验组荧光素酶活性高于对照组。SOHLH1与Sox30启动子上的特异性位点结合,在-489 bp位点的结合作用最强。结论精子发生早期重要转录因子SOHLH1可以直接激活顶体形成相关基因Sox30转录,-489 bp(CAGGTG)为主要特异性结合位点,丰富了精子发生中延时翻译表达调控的现象并进行了调控机制的初步探索。

FOXO3和转录因子SOHLH1对卵母细胞特异性表达基因Bmp15转录活性的调控

目的探究FOXO3和SOHLH1对卵母细胞特异性表达基因Bmp15的调控机制。方法构建Foxo3-pcDNA3.0表达质粒、Bmp15-p GL3.0荧光质粒,用细胞免疫荧光实验验证这2种表达质粒在HEK293T细胞中的表达情况,双荧光素酶报告基因实验检测FOXO3和转录因子SOHLH1对Bmp15启动子区的转录活性的影响,染色质免疫共沉淀实验验证FOXO3和转录因子SOHLH1在Bmp15启动子区的结合情况。结果 Foxo3-pcDNA3.0表达质粒、Bmp15-p GL3.0荧光质粒构建成功。Foxo3-pcDNA3.0、Sohlh1-pcDNA3.0质粒成功转染HEK293T细胞并表达于其细胞核、质中。SOHLH1对Bmp15启动子(-2 000 bp,+200 bp)区域有正调控作用,该作用可被FOXO3抑制,且呈剂量依赖性。SOHLH1蛋白能与Bmp15启动子(-170 bp,80 bp),(-450 bp,-220 bp),(-745bp,-560 bp),(-1 410 bp,-1 200 bp)区间结合。FOXO3能与Bmp15启动子(120 bp,183 bp),(-84 bp,-75 bp),(-442bp,-395 bp),(-546 bp,-470 bp),(-674 bp,-665 bp)区间结合。结论 FOXO3能抑制转录因子SOHLH1对卵母细胞特异性表达基因Bmp15的转录活性。

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2AGFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。【结果】建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLVsgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。【结论】利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。

SOHLH1基因突变与原发性不孕不育的相关性

目的探讨SOHLH1基因突变与原发性不孕不育的相关性。方法运用聚合酶链反应(PCR)和基因测序等方法,对72对原发性男性不育及女性不孕患者及72名已婚育的对照男性和72名已生育的对照女性进行SOHLH1基因外显子区突变筛查及生物信息学分析。结果检索验证发现5处单核苷酸多态性(SNPs)改变和9处新发杂合突变,其中1处新发突变c.890 C>A位于第7号外显子,突变的丝氨酸(Ser)位于DNA结合结构域上游,该改变可能影响其下游调控基因的转录活性,进而导致不孕不育的发生。结论 7号外显子的c.890 C>A突变可能为不孕不育患者SOHLH1基因新发突变,该突变可能引起男性不育及女性不孕。

内在调节蛋白及生长因子对精原干细胞增殖与分化的调控

文章阐述了在转录水平上精原干细胞在增殖与分化过程中的内在调节蛋白Plzf、Sohlh及其对精原干细胞的调节机制。介绍了胶质细胞源性神经营养因子、干细胞因子、Ets相关分子、骨形态发生蛋白、肝细胞生长因子、斯里兰卡肉桂碱受体等由支持细胞分泌的对精原细胞增殖与分化有重要作用的生长因子。

骨形态发生蛋白4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的调控作用

目的探讨骨形态发生蛋白(BMP)4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的调控作用。方法取出生3d的雌性昆明小鼠卵巢,采用两步酶消化法,分离纯化卵母细胞,进行原代培养。将卵母细胞分为3组:正常对照组(Con组)、添加重组人BMP4组(BMP4组)、添加BMP4和BMP4抑制剂6-{4-[2-(1-呱啶基)乙氧基]苯基}-3-(4-吡啶基)吡唑并(1,5-A)嘧啶(dorsomorphin)组(BMP4+抑制剂组)。采用TUNEL法,检测BMP4对卵母细胞凋亡的影响;采用免疫组织化学染色与实时定量PCR,检测BMP4对卵母细胞中p-Smad1/5/8、sohlh2、ckit及foxo3a表达的影响。采用RNA干扰技术、转染sohlh2质粒和LY294002处理,探讨BMP4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡卵母细胞凋亡中的调控机制。结果 TUNEL结果显示,BMP4组凋亡卵母细胞比例明显低于Con组(P<0.05)和BMP4+抑制剂组(P<0.05);加入BMP4可明显促进细胞Smad入核,上调sohlh2和c-kit表达,抑制foxo3a入核;转染sohlh2 siRNA后,可明显阻断BMP4抑制卵母细胞凋亡的作用;转染sohlh2质粒后,p-foxo3a表达量显著增加,LY294002可明显抑制sohlh2促进foxo3a磷酸化的作用。结论激活BMP4/Smad信号通路可抑制小鼠原始卵泡卵母细胞的凋亡,其作用机制可能是通过上调sohlh2和c-kit基因表达,进而调控foxo3a入核而实现的。

补肾填精法通过Bmp4/Smad信号通路对小鼠原始卵泡发育的作用及机制研究

目的探讨补肾填精法通过Bmp4/Smad信号通路对小鼠原始卵泡发育的作用及机制。方法选择雌性小鼠40只,通过透明带3多肽注射建立卵巢早衰(POF)模型,并随机分为模型组和补中药组各20只,其中中药组给予补肾填精法治疗,HE染色法观察各组卵巢及卵巢切片最大截面上原始卵泡、初级卵泡的数量情况;采用TUNEL法观察各组原始卵泡中卵母细胞凋亡情况;Western blotting法检测Bmp4、Smad1、sohlh2及c-kit蛋白的表达情况。结果 HE染色结果显示,与模型组相比,中药组原始卵泡和初级卵泡数量明显增加(P<0.05);TUNEL结果显示,中药组原始卵泡中卵母细胞凋亡率明显低于模型组(P<0.05)。Western Blot结果显示,与模型组小鼠相比,中药组Bmp4、Smad1、sohlh2及c-kit蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论补肾填精法通过激活BMP4/Smad信号通路,促进小鼠原始卵泡发育,并抑制卵母细胞的凋亡,改善卵母细胞质量。

骨形态发生蛋白4/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制

目的:探讨骨形态发生蛋白4(BMP4)/Smad信号通路在小鼠原始卵泡发育中的作用及作用机制。方法:取3日龄昆明雌性小鼠卵巢体外培养,添加重组BMP4,并以不添加BMP4为对照,采用HE染色和TUNEL法,检测BMP4在原始卵泡存活和发育中的作用;采用免疫组织化学、Westernblotting与RT-PCR检测BMP4对原始卵泡中p-Smad1/5/8、sohlh2及c-kit表达的影响。结果:①BMP4组卵巢直径明显变大(1.17±0.24 mm vs 0.65±0.13 mm,P<0.05),原始卵泡数(45.3±4.2枚)明显低于对照组(55.0±5.0枚)(P<0.05),而初级卵泡的数(25.3±2.5枚)明显多于对照组(19.0±1.0枚)(P<0.05)。②TUNEL结果显示BMP4组凋亡卵母细胞比例明显低于对照组(P<0.05)。③免疫组织化学、Western blotting与RT-PCR结果显示,与对照组相比,BMP4组原始卵泡卵母细胞中p-Smad 1/5/8、Sohlh2及C-kit的表达均显著升高(P<0.01)。结论:BMP4/Smad信号通路可促进小鼠原始卵泡向初级卵泡转变,并抑制卵母细胞的凋亡;其可能通过上调Sohlh2及C-kit基因的表达而发挥作用。