猪生殖细胞特异性基因Sohlh1及启动子的研究

【目的】探究猪生殖细胞特异性基因在幼年和成年各组织中的表达情况,分子遗传进化特点,及其启动子的核心区域和特异性调控区间.【方法】通过RT-PCR验证猪不同时期不同组织基因的表达情况,通过生物软件分析其分子遗传进化特点,构建启动子验证载体,通过双荧光素酶分析基因启动子的核心区域和特异性调控区间.【结果】基因在仔猪与成年猪睾丸和仔猪卵巢中都有表达,在成年猪卵巢不表达;通过多个物种进化分析基因随着脊椎动物从低等到高等的演变也在进化;通过双荧光素酶分析构建的启动子验证载体,猪Sohlh1基因的启动子的核心区域在78bp附近,特异性调控区间在771-2981bp之间.【结论】基于基因的进化分析,作为试验动物模型,猪可能更优于啮齿类动物,其组织特异性表达可能主要通过其启动子特异性调控区间调控.

生殖细胞特异性基因SOHLH1与SOHLH2的研究进展

SOHLH1与SOHLH2属于基础型螺旋-环-螺旋(bHLH)转录因子,具有生殖细胞的特异性,在生殖细胞分化及发育早期发挥着重要作用。本文就SOHLH1与SOHLH2的进化、表达及调控机制进行综述,为未来人类生殖相关疾病的研究及治疗提供理论基础。

小鼠生殖细胞特异性转录因子SOHLH1调控Sox30基因表达的机制

目的SOHLH1(Spermatogenesis-and oogenesis-specific bHLH transcription factor-1)和SOX30(SRY box)是与精子发生相关的转录因子,Sohlh1与Sox30的基因敲除雄鼠均丧失生育能力。出生后7天Sohlh1基因敲除雄鼠DNA芯片显示Sox30表达显著下调,本文探究了早期发育相关转录因子SOHLH1对精子发生后期的关键基因Sox30基因的转录调控作用。方法构建Sox30启动子荧光素酶表达质粒,瞬时共同转染Sox30荧光素酶表达质粒和Sohlh1真核表达质粒并利用荧光素酶活性测定实验检测荧光值。通过染色质免疫共沉淀实验检测SOHLH1与Sox30启动子DNA序列特异序列的结合情况筛选主要激活位点。结果共转染Sohlh1真核表达质粒和Sox30启动子区域荧光素酶质粒的实验组荧光素酶活性高于对照组。SOHLH1与Sox30启动子上的特异性位点结合,在-489 bp位点的结合作用最强。结论精子发生早期重要转录因子SOHLH1可以直接激活顶体形成相关基因Sox30转录,-489 bp(CAGGTG)为主要特异性结合位点,丰富了精子发生中延时翻译表达调控的现象并进行了调控机制的初步探索。

FOXO3和转录因子SOHLH1对卵母细胞特异性表达基因Bmp15转录活性的调控

目的探究FOXO3和SOHLH1对卵母细胞特异性表达基因Bmp15的调控机制。方法构建Foxo3-pcDNA3.0表达质粒、Bmp15-p GL3.0荧光质粒,用细胞免疫荧光实验验证这2种表达质粒在HEK293T细胞中的表达情况,双荧光素酶报告基因实验检测FOXO3和转录因子SOHLH1对Bmp15启动子区的转录活性的影响,染色质免疫共沉淀实验验证FOXO3和转录因子SOHLH1在Bmp15启动子区的结合情况。结果 Foxo3-pcDNA3.0表达质粒、Bmp15-p GL3.0荧光质粒构建成功。Foxo3-pcDNA3.0、Sohlh1-pcDNA3.0质粒成功转染HEK293T细胞并表达于其细胞核、质中。SOHLH1对Bmp15启动子(-2 000 bp,+200 bp)区域有正调控作用,该作用可被FOXO3抑制,且呈剂量依赖性。SOHLH1蛋白能与Bmp15启动子(-170 bp,80 bp),(-450 bp,-220 bp),(-745bp,-560 bp),(-1 410 bp,-1 200 bp)区间结合。FOXO3能与Bmp15启动子(120 bp,183 bp),(-84 bp,-75 bp),(-442bp,-395 bp),(-546 bp,-470 bp),(-674 bp,-665 bp)区间结合。结论 FOXO3能抑制转录因子SOHLH1对卵母细胞特异性表达基因Bmp15的转录活性。

利用CRISPR/Cas9系统构建可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系

【目的】将Tet-on系统与CRISPR/Cas9系统相结合建立诱导敲除猪Sohlh1基因的细胞系。【方法】分离培养猪胎儿成纤维细胞(PFF),进行慢病毒载体PCW-eSpCas9(1.1)侵染并通过1μg/mL嘌呤霉素筛选及强力霉素(Dox)诱导;改造pLV-sgRNA载体,进行293FT细胞转染验证;构建含Sohlh1基因目标靶点的pLV-sgRNA-2AGFP特异性载体,进行慢病毒包装检测;利用包装病毒侵染稳转PCW-eSpCas9(1.1)的PFF细胞,3μg/mL灭稻瘟菌素进行筛选,随后添加Dox诱导进行表达分析和敲除效率检测。【结果】建立了受Dox调控可诱导eSpCas9(1.1)蛋白表达的PFF细胞系,不添加Dox,eSpCas9(1.1)蛋白不表达;293FT细胞表达绿色荧光,表明pLV-sgRNA-2A-GFP载体改造成功。3、4、6号Sohlh1基因靶点具有敲除活性,利用最优的2个靶点构建了pLV-sgRNA-2A-GFP特异性载体,荧光表达显示载体慢病毒包装成功。构建稳转PCW-eSpCas9(1.1)和pLVsgRNA-2A-GFP的PFF,经Dox诱导72 h后,Sohlh1基因的敲除效率为85%。【结论】利用Tet-on系统和CRISPR/Cas9系统成功构建了可诱导型猪Sohlh1基因敲除细胞系,为研究Sohlh1基因的功能以及制备条件性敲除Sohlh1基因去除生殖细胞的模型猪奠定了基础。

SOHLH1基因突变与原发性不孕不育的相关性

目的探讨SOHLH1基因突变与原发性不孕不育的相关性。方法运用聚合酶链反应(PCR)和基因测序等方法,对72对原发性男性不育及女性不孕患者及72名已婚育的对照男性和72名已生育的对照女性进行SOHLH1基因外显子区突变筛查及生物信息学分析。结果检索验证发现5处单核苷酸多态性(SNPs)改变和9处新发杂合突变,其中1处新发突变c.890 C>A位于第7号外显子,突变的丝氨酸(Ser)位于DNA结合结构域上游,该改变可能影响其下游调控基因的转录活性,进而导致不孕不育的发生。结论 7号外显子的c.890 C>A突变可能为不孕不育患者SOHLH1基因新发突变,该突变可能引起男性不育及女性不孕。