黄鳝Sox9基因的克隆及其鉴定分析

Ｓｏｘ９基因在人和多种动物中具有进化保守性，在性别决定过程中发挥着重要作用。通过对黄鳝Ｓｏｘ９基因的分子克隆及其限制酶切分析，确定了该克隆的限制酶图谱。从限制酶片段的ＰＣＲ分析以及ＨＭＧ盒的ＤＮＡ序列测定，鉴定该阳性克隆为黄鳝Ｓｏｘ９基因克隆。黄鳝Ｓｏｘ９基因的克隆进一步说明Ｓｏｘ９基因在进化上的高度保守性。对其基因组ＤＮＡ和ｃＤＮＡ序列结构和转基因黄鳝的深入研究，无疑有助于从进化上阐明Ｓｏｘ９基因功能。

鲤鱼Sox9基因HMG保守区的克隆及序列分析

为研究鲤鱼中与性别决定及骨组织发育相关基因Sox 9的特征及功能,从大量常见养殖鲤鱼品种及黄河野生鲤鱼个体中克隆得到了多个版本CcSox 9基因的HMG保守区序列,并对这些序列及国内外的其他鲤鱼Sox基因进行了启动子、多态性等序列分析。结果显示,鲤鱼中至少存在5个版本的活性Sox 9基因及1个Sox 9假基因。这些基因在编码序列中存在一定的多态性,在内含子序列中存在大量序列多态,并且活性基因中都存在至少1个启动子序列。假基因无内含子序列,在编码序列中存在多个终止密码子。

SOX-9和转化生长因子-β1共同诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化

目的探讨应用SOX-9和TGF-β1基因转染大鼠ADSCs(Adipose stromal cells,ADSCs)后,目的基因分泌情况及向软骨细胞的分化效果,为构建新型的组织工程软骨种子细胞提供思路。方法6周龄健康雄性Wistar大鼠2只,体重约150g。扩增、提取质粒pcDNA3.1-TGF-β1、pcDNA3.1-SOX-9。分离、纯化Wistar大鼠ADSCs,倒置相差显微镜观察原代和传代ADSCs形态学改变,免疫荧光法检测细胞表面标志。将SOX-9和TGF-β1基因单独或共转染第3代ADSCs,按转染情况分为5组:对照组、转染空载体组、转染SOX-9组、转染TGF-β1组、SOX-9与TGF-β1共转染组。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Westernblot法检测筛选后细胞的表达。结果免疫荧光法检测ADSCs的CD29、CD44呈阳性反应,CD34、CD106呈阴性反应。MTT法测定各组细胞在490nm波长处的吸光度(A)值,未转染组、空载体组与SOX-9组、TGF-β1组、SOX-9与TGF-β1共转染组间差异显著(P<0.01)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量,SOX-9表达以转染SOX-9组最多;TGF-β1表达以SOX-9与TGF-β1共转染组组最多;II型胶原表达以SOX-9与TGF-β1共转染组最多。结论SOX-9和TGF-β1基因共同转染ADSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向,对组织工程软骨应用于临床具有重要意义。

负载SOX-9的大鼠脂肪干细胞成软骨分化的实验研究

目的SOX-9基因转染大鼠的ADSCs（Adipose stromal cells,ADSCs）,诱导其向软骨细胞分化,为软骨组织工程学种子细胞提供新方法。方法分离、培养大鼠的ADSCs,免疫荧光法进行鉴定;SOX-9基因转染ADSCs,对转染后细胞进行筛选;MTT法测定筛选后细胞的增殖活性;RT-PCR、Western blot对筛选后细胞的表达进行检测。结果成功分离、培养大鼠的ADSCs;细胞表面标志物CD29和CD44表达阳性,CD106和CD34表达阴性;基因转染后细胞的增殖力变强;转染SOX-9的ADSCs在目的基因SOX9、Aggrecan、CollagenⅡmRNA的表达和软骨特异性基质-CollagenⅡ的分泌上明显高于转染空载体组和对照组;结论SOX-9基因转染后ADSCs具有了软骨细胞的表型特征,可以用作软骨组织工程的种子细胞。

Sox-9和igf-1共同诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

目的探讨应用Sox-9和igf-1基因转染大鼠脂肪干细胞(ADSCs)后,目的基因和蛋白分泌情况及向软骨细胞的分化效果。方法扩增、提取质粒pcDNA3.1-igf-1、pcDNA3.1-Sox-9,分离、纯化Wistar大鼠ADSCs,将Sox-9和igf-1基因单独或共转染第3代ADSCs,按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染Sox-9组(C组)、转染igf-1组(D组)、Sox-9与igf-1共转染组(E组)。对转染后细胞进行筛选,MTT法测定筛选后细胞的增殖活性,RT-PCR和Western blot法检测筛选后细胞的表达。结果MTT法测定A、B、C、D、E组细胞在490 nm波长处的吸光度(A)值,A、B组与C、D、E组间差异均有统计学意义(P<0.01),但A、B组以及C、D、E组间差异无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR和Western blot检测目的基因和蛋白的表达量,Sox-9表达以C组最多;igf-1表达以E组最多;II型胶原表达以E组最多。结论通过Sox-9和igf-1基因共同转染ADSCs修复软骨缺损是一个较有前景的发展方向。

SOX-9真核表达质粒转染兔骨髓基质细胞

目的探讨SOX(sry-type high-mobility-group box)-9基因转染兔骨髓基质细胞的方法及可行性。方法构建SOX-9基因真核表达质粒,用脂质体法介导转染兔骨髓基质细胞,通过形态学观察、免疫组织化学、酶联免疫吸附法及反转录-聚合酶链反应检测SOX-9基因转染兔骨髓基质细胞的成功性,以及转染后骨髓基质干细胞的生物学特性。结果免疫组织化学检测实验组细胞内有稳定的SOX-9表达,在2周的表达量高于6d的表达量。RT-PCR结果表明只有实验组有SOX-9的基因表达。酶联免疫吸附法检测结果显示各时间点SOX-9的基因表达实验组均明显高于其余2组(P<0.01),实验组表达量48h时达到最高。结论SOX-9基因可以转染兔骨髓基质干细胞,并能诱导骨髓基质干细胞向成软骨方向分化。

不同浓度TGF-β1对人髓核细胞外基质成分基因表达的调控作用比较

目的研究在体外培养条件下,不同浓度转化生长因子-β1(TGF-β1)对人髓核细胞聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、Ⅱ型胶原及SOX-9基因表达的调控作用。方法以传2代人髓核细胞为研究对象,分别以0.1μg/L、1.0μg/L、10μg/L、100μg/L四种浓度的TGF-β1为培养液,设不含生长因子培养液为对照组,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9 m RNA表达情况。结果 0.1μg/L TGF-β1组与对照组相比,无显著性差异。1μg/L、10μg/L和100μg/L TGF-β1组在促进Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9基因表达方面作用显著,差异均具统计学意义。其中,10μg/L组促进细胞m RNA表达作用最明显。结论 TGF-β1能够促进髓核细胞Aggrecan、Ⅱ型胶原和SOX-9基因的表达,提示TGF-β1有可能在椎间盘退行性疾患的预防和治疗中发挥重要作用。

慢病毒介导的Sox-9基因转染对大鼠关节软骨细胞炎性反应的影响

目的评价Sox-9基因过表达对IL-β诱导的大鼠关节软骨细胞(RCs)炎性反应的影响,为临床提供参考依据。方法通过慢病毒(Lv-Sox-9)感染的方法在RCs细胞中过表达Sox-9,RT-PCR,Western blot检测病毒感染后大鼠软骨细胞中Sox-9、CollagenⅡ基因mRNA及蛋白含量;将细胞分为3组,细胞对照组,IL-1β诱导组,对照病毒感染且IL-1β诱导组和Sox-9过表达且IL-1β诱导组,将软骨细胞或者病毒感染后的软骨细胞接种于纳米孔氧化铝膜上,正常条件培养24h后,诱导组细胞培养液中添加5μg/L的IL-1β,继续培养3d,CCK-8法检测细胞增殖活性变化、扫描电镜观察细胞形态及代谢变化。结果通过慢病毒感染的方法可以在大鼠关节软骨细胞中有效上调Sox-9基因的表达,病毒感染后72h,Lv-Sox-9感染组细胞内Sox-9mRNA和蛋白含量均显著高于细胞对照组和对照病毒组;检测结果还显示,Rcs细胞内CollagenⅡ基因在转录和蛋白表达水平均与Sox-9正相关。结论 Sox-9可以作为抗炎治疗的潜在目标基因。