大豆成熟种子萌发叶片体细胞胚的高频诱导和遗传转化

目的虽然大豆遗传转化取得了较大进展,但其转化效率仍然偏低。因此,有必要建立一个更加简单和高效的大豆转化系统。本研究的目的是以大豆成熟种子萌发产生的叶片(MSDL)为靶外植体,高频诱导和转化大豆体细胞胚(somatic embryos,SEs)。方法萌发7 d的大豆幼苗上摘取叶片,并将其切成1.2 cm×1.2 cm的外植体。将叶片外植体置于胚胎诱导培养基(EIM)上诱导体细胞胚发生。将叶片外植体浸入携带p CAMBIA1301植物表达载体的农杆菌EHA105菌液进行遗传转化。结果MSDL(包括初生叶和次生叶)均能被诱导产生SEs。大多数SE发生在叶片切口处。所试的不同基因型均能诱导SEs。SEs的最高诱导率为95.0%。β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)染色结果表明,平均转化效率达到75.4%。DNA印迹(Southern blot)结果表明,目的基因稳定整合在大豆基因组中,拷贝数为1~3个。结论本研究建立了以大豆MSDL为靶组织的体细胞胚高频诱导和遗传转化。该系统有望在大豆基因组编辑技术的开发上得到应用。

农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化影响因子的研究

用大豆体细胞胚为外植体,以抗性体细胞胚筛选率为转化率的指标,研究了农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化系统的几种影响因子。结果表明,用球形期的体细胞胚受伤处理作为转基因的受体、预培养1.5天有利于转化;筛选不同的代数,转化率在3个月以前明显下降,而在3个月以后则基本稳定在8%左右。

Box-Behnken响应面设计优化微波辅助提取大豆胚芽黄酮的工艺

以大豆胚芽为原料,以乙醇为浸提溶剂,通过微波辅助提取及Box-Behnken响应面设计优化大豆胚芽黄酮的提取工艺,得到最优工艺参数为:提取时间162s,功率687W,料液比1∶18,乙醇浓度68%。经回归分析表明:回归方程的R2=94%,R2Adj=87.99%,预测值为16.33mg/g。经验证,在最优提取工艺条件下,大豆胚芽总黄酮得率为16.16mg/g,回归模型的预测值与实测值的相对误差<1%。

影响大豆体细胞胚萌发率的因素

研究了影响大豆体细胞胚萌发率的几种因素。结果表明 ,基因型间、培养基间大豆体细胞胚的萌发率差异达显著水平 ;同一大豆品种 。

影响大豆体细胞胚诱导因素的研究

体细胞胚的诱导是大豆体外再生的关键。基因型、诱导光周期、外植体的荚位、蔗糖浓度等因素 ,可导致诱导频率及正常胚比例不同 ,影响植株再生。本研究选用黑龙江省主栽大豆基因型的未成熟子叶 ,在含高浓度生长素的MSB培养基上诱导体细胞胚产生。合丰 2 5和东农 781 9为优选基因型 ;生育前期下部荚位大小为 2～ 4mm未成熟子叶体细胞胚发生效果最好 ;四种光周期下体细胞胚诱导频率相近 ,但连续弱光下正常胚比例高 ;NAA诱导优于 2 - 4,D ;1 0mg/lNAA与1 .

大豆体细胞胚的成熟处理及植株再生

选用体细胞胚高频发生的黑龙江省主栽大豆品种 (东农 7819)的未成熟子叶 ,在含高浓度的生长素 MSB培养基上诱导体细胞胚的产生。体细胞胚分别置于 M3、M10、MC三种成熟培养基上或单纯置于灭菌过的培养皿进行干化处理。成熟处理为大豆体细胞胚萌发所必需。单纯干化处理不利于体细胞胚存活 ,而在高渗成熟培养基 MC或 M10成熟处理过的体细胞胚在 MSG(1/2 MSB+ GA)萌发培养基上的萌发率明显高于 M3。成熟处理后 ,形态正常体细胞胚的萌发率达90 % ,明显高于形态不正常胚 4 %的萌发率。对成熟处理过的体细胞胚的组织学研究表明 ,形态学上苗端未分化是形态不正常胚不能形成完整植株的原因之一。

农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化系统的优化研究

以大豆球形期体细胞胚为外植体 ,以抗性体细胞胚筛选率为指标 ,对影响农杆菌介导的大豆体细胞胚遗传转化频率的因子进行了优化。结果表明 ,菌液浓度以OD6 0 0 =0 .5 - 0 .7、AS浓度为5 0 - 10 0 μmol/L、侵染时间 10分钟、共培养时间 2 - 3天 ,有利于提高转化率。

大豆体细胞胚再生植株的研究

以球形期大豆体细胞胚为材料,对其进行继代增殖、萌发及再生植株的研究。结果表明,大豆体细胞胚每隔15-20天分割成3mm左右的小块在MS培养基附加10-20 mg/L 2,4-D的固体培养基以及弱光条件下,可以继续增殖,继代增殖能力强,扩繁系数为3n(n为继代培养次数);大豆体细胞胚性组织先在含有活性碳的培养基上培养,能提高其萌发率以及正常胚率,1个月以后转移到无活性碳的培养基,又能提高其再生速度以及再生率。

用基因枪法将Bt基因转入大豆的研究

以大豆品种合丰25的体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,经体细胞胚萌发、生根及壮苗培养和卡那霉素选择培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中。

大豆胚芽索氏提取法制油工艺条件初步研究

以石油醚(60～90℃)作为脱脂溶剂对大豆胚芽进行索氏提取,采用L9(33)正交表进行分析,以大豆胚芽出油率为指标,确定大豆胚芽制油的最佳工艺参数为:粒度30目,料液比1∶13,回流时间5h。

大豆胚芽油提取工艺的研究

以大豆胚芽出油率为指标,石油醚为脱脂溶剂,通过单因素和正交试验对大豆胚芽索氏提取工艺进行了研究。结果表明:大豆胚芽制油的最佳提取工艺为:粒度30目,料液比1:13,回流时间5h。在此条件下,大豆胚芽出油率为10.50%。

大豆幼胚培养直接成苗影响因素研究

为建立大豆幼胚培养直接成苗方法,分别研究了大豆幼胚胚龄、幼胚预处理方法、培养基及大豆品种对大豆幼胚培养直接成苗的影响。结果表明:15 d胚龄的幼胚平均萌发率为23%,20 d及以上胚龄的幼胚萌发率高于70%,20 d胚龄的幼胚虽能萌发,但芽和根的正常生长较为困难。在低温(4℃)、高温(37℃)和GA(100 mmol.L-1)预处理幼胚2 d再进行培养条件下,高温预处理平均成苗率达75%;而低温和GA预处理的成苗率只有4%。所试几种培养基对幼胚成苗效果没有显著影响。不同品种中,极早熟品种日本晴和台农292成苗率分别为74%和72%,早熟品种台湾75和苏早1号成苗率均为64%,夏大豆临豆8号成苗率(54%)最低。

基因枪法对大豆进行CpTI基因的遗传转化

以大豆品种合丰25的球形期体细胞胚为受体,以CpTI基因为目的基因,应用基因枪法进行了遗传转化,同时以抗性体细胞胚筛选率作为转化率的指标,对影响基因枪转化的几个参数进行了优化研究。结果表明,氯化钙浓度2.5 mol/L、氦气压力1 100 Psi、轰击次数为2次,有利于提高转化率;经卡那霉素筛选得到抗性植株,经PCR分析鉴定有2株为阳性,初步证明外源基因CpTI已转到大豆基因组内。

适于体细胞胚发生的大豆基因型筛选

以41个北方春大豆品种为材料,研究了不同基因型大豆体细胞胚的诱导率。结果表明:不同基因型大豆的体细胞胚发生率有显著差异,在供试品种中,垦丰23的体细胞胚胎发生率(99.7%)最高,合丰55等9个基因型体细胞胚诱导率为70%～90%;登科4等5个基因型无体细胞胚发生。垦丰23体细胞胚呈葡萄状、颜色鲜绿、每个未成熟子叶上体细胞胚的数量较多、无畸形胚、且每个体细胞胚是独立存在的,其他诱导率较高的基因型每个未成熟子叶分化体细胞胚的数目较少,且部分基因型含有畸形胚。

农杆菌介导法转化大豆体细胞胚获得转基因植株

以六个品种大豆体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对大豆进行了遗传转化,经卡那霉素选择、诱导体细胞胚萌发及壮苗培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中。

农杆菌介导法将Bt基因转入大豆的研究

以6个品种大豆体细胞胚为受体,以Bt基因为目的基因,应用根癌农杆菌介导法对大豆进行了遗传转化,经体细胞胚萌发、生根及壮苗培养和卡那霉素选择培养,获得了完整的抗性再生苗,经PCR、PCR-Southern和点杂交分析鉴定,初步证明外源基因Bt已整合到大豆的基因组中。

2,4-D对大豆体细胞胚胎发生及增殖的影响

研究不同浓度的2，4-D对不同基因型大豆体细胞胚胎发生及增殖的影响：结果表明：不同基因型大豆体细胞胚胎发生率存在显著差异，在供试的6种基因型中，以CH21141和黑农40体细胞胚胎发生率最高，黑农35诱导率最低；大豆体细胞胚胎发生及继代增殖的最佳2，4-D浓度为10～20mg·L^-1，继代扩繁系数为3^n（n为继代培养次数）.

大豆体细胞胚的诱导及对草甘膦耐性的研究

以大豆未成熟子叶为外植体,研究合丰25、吉林35、吉育91对未成熟子叶体细胞胚诱导率的影响,并探讨3种基因型大豆未成熟子叶对草甘膦的耐性。结果表明:3种基因型的愈伤组织诱导率均为100%,体细胞胚诱导率为53.95%～72.12%,平均胚数吉育91高于其它2种基因型。3种基因型的体细胞胚诱导率在草甘膦浓度间存在差异,在大豆以未成熟子叶为受体转基因时,诱导体细胞胚胎发生的草甘膦筛选浓度为2.5～5.0 mg.L-1。

根癌农杆菌介导抗菌肽基因转化大豆的研究

为利用抗菌肽基因培育转基因大豆抗病材料,采用根癌农杆菌介导法将抗菌肽基因和绿色荧光蛋白融合基因转入大豆胚尖外植体。结果表明,60mg/L的卡那霉素可以对转化植株进行有效的筛选;在共培养时添加200μmol/L乙酰丁香酮有利于抗菌肽基因的转化;在生根培养基中不添加卡那霉素更有利于转化苗的成活。目的基因特异的PCR检测和绿色荧光蛋白表达分析,发现抗菌肽基因已转入大豆,并得到表达。

大豆体细胞胚诱导再生的影响因素和相关基因的研究进展

大豆是世界上重要的油料和经济作物,也是种植面积最大的转基因作物。大豆体细胞胚再生途径的转基因方法至今仍没有较大突破,主要原因是体细胞胚诱导再生频率低且不稳定,同时受基因型影响明显,这些原因限制了其在不同大豆品种中的应用。文章对影响大豆体细胞胚频率的基因型、激素、p H及其它因素进行了梳理总结,从同源克隆、基因定位和重测序等方面对体细胞胚诱导再生的相关基因的研究进展情况进行了详细综述。并对大豆体细胞胚诱导再生的应用前景和存在问题进行了归纳分析,旨在为大豆体细胞胚诱导再生的进一步研究提供参考。