金黄色葡萄球菌SPA分型及毒力基因检测

目的:研究临床分离金黄色葡萄球菌(SA)的蛋白A基因多态性及其所携带的毒力基因,为控制SA的感染和传播提供基础理论依据。方法:选取2018年10月—2019年3月北京航天总医院检验科微生物室分离得到的临床来源非重复金黄色葡萄球菌50株,其中来源于痰液35株、血液6株、脓液3株。其他来源6株(包括尿液、胸水、腹水等)。检测菌株携带mecA基因和杀白细胞毒素(PVL)基因等7种毒力基因的情况,并对菌株进行SPA基因分型分析。结果:50株SA菌株中,共检出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)28株(56.0%),其中mecA基因阳性28株(100%);甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)22株(44.0%),mecA基因均为阴性。MRSA分为4个SPA型别,以t030(82.1%)为主,MSSA共分为12个葡萄球菌蛋白A(SPA)型别,以t1451、t091和t078位列前3位,分别占22.7%、18.2%和13.6%,检出2株PVL阳性菌株。结论:t030是MRSA临床分离株中的SPA优势型别,在本医院内广泛传播。MSSA遗传多样性高,以t1451、t091和t078位列前3位。

进出口食品中金黄色葡萄球菌spa基因的分型

目的对我国进出口食品中分离得到的金黄色葡萄球菌进行spa基因分型。方法对36株金黄色葡萄球菌的spa基因进行PCR扩增,并对产物进行测序分析,测序结果通过数据库进行spa基因分型。结果共分出16个基因型,分别为t189、t091、t164、t002、t899、t197、t1044、t034、t156、t7400、t2592、t4209、t127、t437和两株新发现的基因型。其中t189型共有13株,t091型共4株,t164和t002型分别为3株,其余型分别为1株。结论 食品中分离出的36株金黄色葡萄球菌spa分型以t189居多,t091型次之,其他14型相对较少。

SPA基因启动子的克隆及转录靶向活性分析

目的:克隆大鼠肺表面活性蛋白A(SPA)基因启动子并构建该启动子的荧光报告系统,探讨该启动子的活性及转录靶向性,为进一步研究SPA基因的表达调控机制和探讨靶向性基因治疗奠定基础。方法:①从GenBank中获取大鼠SPA基因序列,对其上游基因组序列进行计算机生物信息学分析,推断其上游序列约163bp的区域具有启动子功能。②利用PCR技术扩增SPA基因上游启动子序列,将其亚克隆入pGL3-basic中,构建pGL3-SPA质粒,将其亚克隆于pGL3-control中,构建pGL3-SPA-enhancer质粒。③将构建pGL3-SPA质粒、pGL3-SPA-enhancer质粒、pGL3-control质粒和pGL3-basic质粒分别与内参质粒pRL-TK共转染入A549细胞和H441细胞,用双荧光素酶报告系统检测该质粒在两种细胞中的荧光素酶活性表达。结果:酶切及测序结果均证实成功克隆了SPA基因启动子序列,并已将该序列正确插入到荧光素酶报告基因系列载体中。重组的pGL3-SPA-enhancer质粒、pGL3-SPA质粒转染H441细胞后可以检测到荧光素酶的高表达。结论:成功构建了含有SPA基因启动子序列的荧光素酶基因报告系统,证实了它在高表达SPA蛋白的细胞中有较高的转录活性,为下一步研究SPA基因功能及其转录调控以及探讨基因治疗的靶向性奠定了基础。

丹毒丝菌SpaA基因免疫保护区的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母Pichia pastoris X-33为宿主表达猪丹毒丝菌Erysipelothrix rhusiopathiae Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.【方法】以采集于广东某猪场的猪丹毒丝菌为模板,根据NCBI中已发表的Spa基因c DNA序列设计1对引物,通过PCR扩增得到Spa A-N,并将其连接到表达载体p PICZαC上,得到重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N;用Sac I酶将重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N线性化后电转化入毕赤酵母X-33,经含博来霉素ZencinTM抗性的YPDS平板筛选和PCR鉴定的阳性转化子,用含不同浓度博来霉素抗性的YPDS平板筛选出高拷贝子并进行甲醇诱导培养,分别于诱导48、72、96 h后离心收集上清液,立即做SDS-PAGE,并进行SDS-PAGE及Western-blot试验.【结果和结论】成功克隆并表达了Spa A-N基因,构建了重组表达质粒p PICZαC-Spa A-N,并以毕赤酵母X-33为宿主成功表达了猪丹毒丝菌Spa A基因氨基端的免疫保护区蛋白.丹毒丝菌Spa A-N作为免疫保护区在酵母宿主中得以成功表达.

拟南芥角果角度相关基因SPA的分子鉴定与功能分析

利用T-DNA插入突变的方法从拟南芥中筛选得到1个角果果柄生长角度变小的突变体,克隆得到该突变基因为SPA基因,并利用PCR和RT-PCR方法验证了T-DNA的插入位点;将SPA基因转入spa突变体后,互补植株角果角度恢复到野生型水平.推测SPA基因可能在调控角果角度方面具有重要功能.

基于SPA的蛋白质编码基因的比对

给出了二重比对 SPA 算法的一个扩展,把 SPA 算法推广到蛋白质编码基因的比对中.首先利用经典的密码子进化模型,得到了密码子两两的得分矩阵,并用该矩阵对 SPA 算法进行了修改,使其更加合理有效地应用于蛋白质编码基因的比对.

SPA/SPG融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

葡萄球菌A蛋白（SPA）和链球菌G蛋白（SPG）的IgG结合区编码基因融合后，克隆到大肠杆菌表达载体PGEX，SPA／SPG融合蛋白（SPAG）得到高效表达。可溶性SPAG～GST产物可被谷胱甘肽亲和柱一次性纯化。用琼扩和ELISA试验测定了表达产物与不同种属动物血清反应的性能。SPAG—GST与所有SPA、SPG各自反应的动物IgG结合，对小鼠IgG的反应优于SPA或SPG。在所测试的23种动物血清中，融合蛋白与大部分哺乳动物Ig反应。

市售凉皮中金黄色葡萄球菌的肠毒素基因、耐药特征检测及SPA分型

为监测并研究凉皮中金黄色葡萄球菌的污染情况,选取连锁超市、流动摊点、小餐馆和学校餐厅4种销售渠道,在陕西杨凌地区进行为期一年的凉皮跟踪采样,共得样本432个,金黄色葡萄球菌检出率为24.3%(105/432)。检测sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej 9种肠毒素基因,sea携带率最高为96.2%(101/105),see次之为64.8%(68/105),还有部分seb和sec检出,检出率分别为54.3%(57/105)和49.5%(52/105),seh检出率为1.0%(1/105),sed、seg、sei、sej的检出率则均为0.0%(0/105)。研究针对青霉素、氨苄西林和苯唑西林等14种常见药物进行耐药性实验,105株来自阳性样本的金黄色葡萄菌全部具有耐药性,对青霉素和甲氧苄啶/磺胺甲恶唑耐受率为100.0%(105/105),对头孢哌酮、环丙沙星、万古霉素和阿米卡星均敏感。此外,多重(n≥3)耐药率高达90.5%(95/105),表型为青霉素-氨苄西林-甲氧苄啶/磺胺甲恶唑-阿莫西林/克拉维酸的耐药率最高,为61.9%(65/105)。检测105株金黄色葡萄球菌的SPA型别,共包括4种结果,优势型别为t701(81.9%,86/105),其次是t441(16.2%,17/105),t127和t796占比最少均为1.0%(1/105)。最终,发现该地区所售凉皮除学校餐厅外,其余3种销售渠道的检出率均较高,且菌株具有较高的肠毒素基因携带率和耐药性,优势SPA型别为t701和t441,为相应监管部门提供一定理论指导。

原发性肺腺癌中Napsin A、TTF1及SPA蛋白的表达及其与EGFR基因突变的相关性

目的探讨Napsin A、TTF1、SPA在原发性肺腺癌中的表达及与EGFR基因突变的相关性。方法免疫组织化学法检测306例原发性肺腺癌组织中Napsin A、TTF1、SPA蛋白的表达。ARMS法同时检测这些组织中EGFR基因是否突变。结果 Napsin A在原发性肺腺癌中表达率为87.25%,TTF1在原发性肺腺癌中表达率为80.72%,SPA在原发性肺腺癌中表达率为60.46%。EGFR基因在原发性肺腺癌中的突变率为40.20%。TTF1、Napsin A、SPA蛋白表达阳性患者EGFR基因突变率均较表达阴性患者高,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论我们可以通过检测Napsin A、TTF1和SPA是否表达来简单预测原发性肺腺癌中EGFR基因是否会有突变,这对于一些组织不够用于开展分子检测的患者或不能开展分子检测的医院十分实用。

牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究

为了检测重组蛋白SPAG11D的抑菌活性,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增了SPAG11D基因,将该基因插入p ET-32a(+)融合表达载体,并转入BL21(D3)进行原核表达,通过改变IPTG浓度和诱导时间优化表达条件,并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增牛SPAG11D基因,产物大小为390 bp,其序列与Gen Bank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体p ET-32a(+)-SPAG11D,重组蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间为4 h;表达产物的分子质量约为33 k Da;该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛SPAG11D基因的原核表达载体,并获得了具有抑菌活性的重组蛋白His-SPAG11D。

医院环境及临床分离MRSA分子流行病学研究

目的研究医院环境及临床分离耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)分子流行病特征,为MRSA的医院感染防控提供依据。方法使用MicroScan walkaway-40SI全自动微生物分析仪对医院环境与临床分离MRSA进行鉴定。通过多重PCR扩增特异基因片段进行SCCmec基因分型,并应用spa分型技术进行同源性分析。结果 SCCmec分型结果显示,环境分离的7株MRSA分为两型:其中SCCmecⅢ型6株;SCCmecⅣ型1株。临床分离44株MRSA分为四型:其中SCCmecⅡ型8株、Ⅲ型22株、Ⅳ型12株、Ⅴ型1株,未检出Ⅰ型菌株,并有1株未能分型。SCCmecⅢ型MRSA主要分布在新生儿监护病房(NICU)、呼吸内科、重症监护病房(ICU)和神经外科。对MRSA进行spa基因分型可见:NICU主要流行株为t437型,呼吸内科主要流行株为t030型,而ICU和神经外科流行株均为t034型,且上述科室环境与临床分离株高度同源。结论医院环境与临床分离的MRSA均以SCCmecⅢ型为主。spa分型结果显示两类MRSA同源性较高,科室之间存在同型MRSA的交叉传播。MRSA定植于医院环境是导致其医院感染流行传播的重要因素。

异质性万古霉素中介的金黄色葡萄球菌的分子特征

目的了解我院异质性万古霉素中介的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分布及分子学特征。方法对2015年10月至2016年5月我院临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,采用菌群分析策略-曲线下面积法(PAP-AUC)筛选异质性万古霉素中介的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;采用多重PCR法对hVISA进行agr、spa、SCC基因分型测定,对PCR产物进行测序确定spa分型。结果分离的79株MRSA经筛选获得9株h VISA;9株hVISA中有7株为agr-Ⅰ型,2株为agr-Ⅲ型;有6种spa克隆型,包括t437(4株),t114(1株)、t2310(1株)、t14062(1株)、t030(1株)、t16472(1株)。SCCmec分型以Ⅳa型为主,占55.56%,其次为Ⅲ型33.33%、Ⅱ型11.11%。结论我院hVISA检出率为11.39%,呈多克隆流行。

家蚕Atlastin基因(BmATL)的鉴定及表达模式

Atlastin基因是人类遗传性痉挛性截瘫(hereditary spastic paraplegia,HSP)疾病的致病基因之一。Atlastin蛋白具有典型的GTP结合(GBP)结构域和2个相邻的跨膜结构,被定位在高尔基体和内质网膜上,具有运输小囊泡的功能。用人类和果蝇的Atlastin基因序列对家蚕基因组数据库进行同源搜索,鉴定得到4个同源基因,命名为BmATL1-BmATL4。生物信息学分析显示这4个基因编码的蛋白质都有GBP结构域,其中:BmATL1和BmATL2的分子质量约60 kD,有2个相邻的跨膜结构;BmATL3和BmATL4的分子质量约85 kD,没有跨膜结构。表达谱分析表明BmATL1和BmATL2在家蚕5龄第3天幼虫各组织都有低量表达,BmATL3和BmATL4在血细胞中特异高量表达。综合分析提示:BmATL1与人类和果蝇Atlastin的分子质量、结构域和表达谱特征相似。

金黄色葡萄球菌抗生素耐药相关基因检测及蛋白A基因多态性分型研究

目的 检测2011-2012年深圳市南山区某医院及环境样本中金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus,SA）耐药基因,对SA进行蛋白A基因多态性分型（single locus DNA-sequencing of the repeat region of the Staphylococcus protein Agene,Spa）研究.了解SA耐药基因分布情况以及Spa分型特点.方法 采用PCR技术检测SA的12种耐药基因,对SA蛋白A基因进行扩增,PCR产物测序,序列上传数据库进行比对.结果 27株菌分离自院内病人样本,13株检出mecA基因.其中15株菌检出2种以上耐药基因,3株菌未检出任何耐药基因.16株菌分离自环境样本,未检出mecA基因.15株菌检出ant（4＇,4＂）基因,仅1株菌检出Aac（6＇）/aph（2＂）基因,其余耐药基因未检出.43株SA分为15种Spa型,t091型为优势型别,检出率为27.9％（12/43）,此型别在所有类型的样本中均有检出.结论 院内样本中,不同样本分离菌株携带耐药基因存在差异,院内病人样本分离菌株呈多重耐药.Spa分型,利于深圳市SA分子分型数据库的建立,对于疾病溯源有着重要意义.

环介导等温扩增法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌

建立一种应用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistan Staphylococcus aureus,MRSA)中mecA和spa基因的检测方法。以金葡菌和其他相关菌种为试验对象,分别用聚合酶链式反应(ploymerase chain reaction,PCR)和LAMP方法检测mecA和spa基因。结果表明:LAMP法在64℃等温条件下可在60min内成功扩增基因,且与传统PCR方法结果相同;通过琼脂糖凝胶电泳可知,LAMP对mecA和spa基因的检测限分别为每菌管102个和10个细胞;肉眼可检测到的mecA和spa基因的检测限分别为每菌管103个和10个细胞;然后用LAMP法检测人工污染原料乳样本中MRSA,用LAMP法检测原料乳中的mecA和spa基因与PCR方法显示出相同的结果。LAMP方法可快速检测mecA和spa基因,此方法可应用于原料乳中MRSA的检测。

金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因的检测

目的对金黄色葡萄球菌(金葡萄)的耐消毒剂基因qac A/B进行检测分析。方法收集重庆市奉节县人民医院2014年1—12月住院患者中分离的金葡菌51株,采用药敏试验、PCR技术进行mec A和qac A/B检测,筛选出的携带有qac A/B基因的金葡菌进行spa分型,并分析相应的临床情况和对16种抗菌药物的耐药模式。结果金葡菌中mec A和qac A/B检测率分别为21.6%(11/51)和13.7%(7/51);耐甲氧西林金葡菌(MRSA)菌株中qac A/B阳性率为54.5%(6/11),甲氧西林敏感金葡菌(MSSA)菌株中qac A/B阳性率为2.5%(1/40),阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。7株qac A/B经spa分型发现4个型,分别为t037、t091、t932、t895,其中t037有4株来源于儿科病房,其余菌株各1株,以t037型别为主。结论该院分离出携带耐消毒剂qac A/B基因的金葡菌,MRSA携带率明显高于MSSA,并且可能至少存在1个来自院内的克隆株在儿科病房流行。

一种新型抗体导向核酸转移系统关键组分的制备及鉴定

目的制备并鉴定葡萄球菌A蛋白-多聚赖氨酸交联物(SPA-PLL交联物),以此交联物为"接头",构建一种新型的抗体导向核酸转移系统。方法采用SPDP化学偶联法制备SPA-PLL交联物;采用SDSPAGE电泳法测定SPA-PLL交联物的纯度;采用酶联法或DNA凝胶阻滞实验分别测定SPA-PLL交联物与IgG或DNA片段的结合;将SPA-PLL交联物与Tfr抗体和p EGFP-C1质粒以适宜的质量比混合即可组装成Tfr抗体导向pEGFP-C1质粒转移系统;将该抗体导向的pEGFP-C1质粒转染人肝癌HepG2细胞,在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达。结果 SPA-PLL交联物纯度较高,能良好地结合多种Ig G抗体,同时也能较好地结合pEGFP-C1质粒、中和其负电荷;Tfr抗体导向pEGFP-C1质粒转移系统能特异性地转染Hep G2细胞,并使pEGFP-C1质粒在细胞中有效表达。结论 SPA-PLL交联物能与核酸片段和IgG抗体非共价结合,并具有良好通用性;以此制备抗体导向核酸转移系统的过程简单方便。

马鞍山市金黄色葡萄球菌鉴定及SPA基因多态性分析

目的鉴定分离自马鞍山的金黄色葡萄球菌,探索使用金黄色葡萄球菌SPA基因对菌株进行多态性分析。方法采集马鞍山市食品、食物中毒和腹泻患者标本,按照GB/4789.10-2003和WS/T80-1996进行金黄色葡萄球菌的分离培养。对分离的菌株,用过氧化氢酶和血浆凝固酶试验后,用生化实验对菌株进行鉴定。提取鉴定为金黄色葡萄球菌的DNA作为模板,PCR扩增菌株的SPA蛋白X区域并测序,测序结果提交数据库(http://www.seq-net.org/)进行分型,采用分型软件Ridom Staph Type对分型结果进行聚类分析。结果 共分离和鉴定54株金黄色葡萄球菌,其中食品、食物中毒和腹泻标本分别为36株、11株和7株。所有菌株的过氧化氢酶及血浆凝固酶均为阳性,生化实验鉴定为金黄色葡萄球菌。54株菌株可分成19个型,分别为t 189型11株、t 701型9株、t 091型7株、t 1376型5株、t 011型、t 127型各2株、t 084型、t 163型、t 459型、t 547型、t 548型、t 791型、t 954型、t 1544型、t 4336型、t 5269型、t 5353型各1株,同时发现2个新型,分别为t 5269和t 5353型。两起食物中毒的型别分别为t 189型和t 701型。结论 SPA基因分型方法具有快速、易于标准化的特点,可用于食物中毒的流行病溯源。

金黄色葡萄球菌毒力基因检测及Spa分型研究

目的研究深圳市南山区2009 2015年医院内患者临床检测标本、医院台面与医护人员双手涂抹样以及食物中毒样本中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)蛋白A基因多态性分型(single locus DNA-sequencing of the repeat region of the Staphylococcus protein A gene,Spa)的特征及毒力基因分布情况。方法采用多重PCR方法检测SA的mec A与fem A基因,PCR方法检测24个毒力基因以及SA蛋白A基因,PCR产物测序后序列上传数据库进行比对。结果 87株SA共检出48株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA),检出率为55.2%。共检出21种毒力基因,检出率>60%的毒力基因有LUKDE(65.5%)、SHE(67.8%)、mpHLG2(85.1%)、HLD(93.1%)和HLA(100.0%)。94.3%菌株携带5个以上毒力基因。三类样本中有11种毒力基因检出率差异有统计学意义,分别是SEB、mpSEC、mpSEJ、mpSEO、TST、HLB、HLD、mpHLG1、mpHLG2,mpETB和PVL。其中mpETB与PVL仅在患者中检出,肠毒素基因在食物中毒株中携带率较高。MRSA与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(methicillin-sensitive S.aureus,MSSA)的3种毒力基因检出率差异有统计学意义,分别是mpETA、PVL及mpHLG2;MRSA的毒力基因mpETA与PVL检出率明显高于MSSA(P=0.033,P=0.030),而mpHLG2检出率明显低于MSSA(P=0.021)。87株SA分为24种Spa型,患者优势型别为t030(30.0%)与t437(36.7%),医院其他样本优势型别为t091(50.0%),食物中毒优势型别为t127(36.8%)与t091(21.1%)。结论三类样本部分毒力基因检出差异有统计学意义。MRSA与MSSA携带毒力基因差异无统计学意义。三类样本中均存在优势的Spa型别。

瑞安地区社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌spa分型和耐药特征

目的研究瑞安地区社区获得性MRSA的PVL毒力基因、spa分型和耐药特征。方法收集2011年1月-2013年12月,瑞安人民医院分离的社区获得性金黄色葡萄球菌132株,头孢西丁纸片法筛选MRSA;对CA-MRSA患者收集病史资料,PCR法检测PVL基因,PCR测序进行spa分型,采用whonet 5.6进行耐药谱分析。结果 132株社区获得性金黄色葡萄球菌有36株为CA-MRSA,其中17株PVL基因阳性;36株spa分型有18种,其中t437有12株占33.3%;36株CA-MRSA耐药谱主要为POEC(青霉素、苯唑西林、红霉素、克林霉素)占36.1%。结论瑞安地区CAMRSA PVL基因阳性比例不高,不能使用PVL基因来确认是否CA-MRSA感染,PVL基因患者主要见于皮肤软组织感染,瑞安地区CA-MRSA spa分型主要为t437,主要耐药谱为POEC的耐药模式。