鸦胆子苦醇调节SPHK1/S1P/S1PR3信号通路对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响

目的探讨鸦胆子苦醇调节鞘氨醇激酶1(SPHK1)/鞘氨醇-1-磷酸(S1P)/鞘氨醇-1-磷酸酯受体3(S1PR3)信号通路对卵巢癌细胞恶性生物学行为的影响。方法将体外培养的人卵巢癌细胞株SKOV-3随机分为对照组、鸦胆子苦醇组、SPHK1过表达组、鸦胆子苦醇+空载组、鸦胆子苦醇+SPHK1过表达组,检测各组细胞活力、克隆形成率、迁移数、侵袭数、凋亡率以及增殖相关蛋白[骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物(C-myc)]、凋亡相关蛋白[B细胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、上皮间质转化(EMT)相关蛋白[上皮钙黏素(E-cadherin)、神经钙黏素(N-cadherin)]及SPHK1、S1P、S1PR3蛋白表达量。采用SKOV-3细胞构建裸鼠移植瘤模型,随机分为对照组、鸦胆子苦醇低剂量组、鸦胆子苦醇中剂量组、鸦胆子苦醇高剂量组、SPHK1过表达组、鸦胆子苦醇高剂量+空载组、鸦胆子苦醇高剂量+SPHK1过表达组,检测各组移植瘤生长情况;随机分为对照组、鸦胆子苦醇组、SPHK1过表达组、鸦胆子苦醇+空载组、鸦胆子苦醇+SPHK1过表达组,检测各组移植瘤组织中增殖、凋亡、EMT及SPHK1/S1P/S1PR3信号通路相关蛋白表达量。结果体外实验显示,与对照组相比,鸦胆子苦醇组细胞活力、克隆形成率、迁移数、侵袭数和C-myc、Bcl-2、Ncadherin、SPHK1、S1P、S1PR3蛋白表达量均显著降低(P<0.05),凋亡率和Bax、E-cadherin蛋白表达量均显著升高(P<0.05);过表达SPHK1可减弱鸦胆子苦醇对SKOV-3细胞上述指标的影响。体内实验显示,与对照组相比,鸦胆子苦醇低、中、高剂量组裸鼠干预21 d后的移植瘤体积均显著降低并呈剂量依赖性(P<0.05);高剂量鸦胆子苦醇还可显著降低移植瘤组织中C-myc、Bcl-2、Ncadherin、SPHK1、S1P、S1PR3蛋白表达量(P<0.05),显著升高Bax、E-cadherin蛋白表达量(P<0.05);过表达SPHK1可减弱鸦胆子苦醇对移植瘤组织上述指标的影响。结论鸦胆子苦醇可通过下调SPHK1/S1P/S1PR3信号通路蛋白表达,进而抑制卵巢癌细胞体外增殖、克隆、EMT、迁移及侵袭并诱导其凋亡,还可抑制卵巢癌细胞在裸鼠体内的生长,最终抑制其恶性生物学行为,对卵巢癌起到显著的抗癌功效。

阿芬太尼调节SphK1/S1P信号通路对急性心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响

目的探究阿芬太尼(ALF)调节鞘氨醇激酶1(SphK1)/1-磷酸鞘氨醇(S1P)信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心肌纤维化的影响。方法取雄性SD大鼠,采用左冠状动脉前降支结扎法构建AMI模型,并将造模成功的大鼠随机分为AMI模型组(Model组)和低剂量ALF组(ALF-L组,予0.25 mg/kgALF)、高剂量ALF组(ALF-H组,予0.5 mg/kgALF)、高剂量ALF+SphK1激活剂组(ALF-H+K6PC-5组,予0.5 mg/kgALF+1μg/g K6PC-5),同时设置仅进行开/关胸操作而不作左冠状动脉前降支结扎的假手术组(Sham组),每组15只。各药物组大鼠腹腔注射相应药液,每天1次,连续4周。末次给药12 h后,检测各组大鼠的心功能指标[左室收缩压(LVSP)、左室射血分数(LVEF)、左室收缩期内径(LVSD)、左室短轴缩短率(LVFS)],观察其心肌梗死情况、心肌组织病理改变和纤维化程度,检测其血清脑钠肽(BNP)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)水平以及心肌组织中Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、collagenⅢ、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、SphK1、S1P蛋白的表达水平。结果与Sham组比较,Model组大鼠心肌组织细胞排列紊乱,可见大量炎症细胞浸润;LVSP、LVFS、LVEF均显著降低(P<0.05);LVSD,心肌梗死面积、心肌组织胶原容积分数,血清BNP、cTnⅠ水平,心肌组织中collagenⅠ、collagenⅢ、MMP-2、SphK1、S1P蛋白的表达水平均显著升高或增大(P<0.05)。与Model组比较,ALF各剂量组大鼠心肌组织病理改变和纤维化程度均有所改善或减轻,ALF-H组大鼠各定量指标均显著改善且显著优于ALF-L组(P<0.05);K6PC-5可显著逆转高剂量ALF对大鼠上述各定量指标的改善作用(P<0.05)。结论ALF可减轻AMI大鼠心肌纤维化,改善其心功能,该作用可能与抑制SphK1/S1P信号通路有关。

SphK1/S1P/S1PR2信号通路促进肌生成:运动改善骨骼肌健康的新视角

背景:近年来,运动改善骨骼肌的健康已成为学者们关注的一个重要研究内容,适宜的运动对骨骼肌具有积极的作用,其中在运动激活鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1,SphK1)/鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)/鞘氨醇-1-磷酸受体2(sphingosine-1-phosphate receptor2,S1PR2)信号通路如何改善骨骼肌的健康,正受到科研人员的重视。目的:研究运动经SphK1/S1P/S1PR2信号通路如何改善骨骼肌的健康,探索治疗相关肌肉疾病的新方法,以改善人的骨骼肌健康。方法:检索Web of Science、PubMed、中国知网、万方和维普数据库从建库至今与文章主题相关的文献,以“signaling pathway,SphK1,S1P,S1PR2,skeletal muscle,satellite cell,myogenesis,exercise”为英文检索词,以“信号通路,SphK1,S1P,S1PR2,骨骼肌,卫星细胞,肌生成,运动”为中文检索词,最终纳入69篇文献进行分析。结果与结论:①SphK1/S1P/S1PR2信号通路是一个复杂的调控网络,通过SphK1催化产生的S1P,与S1PR2等受体的相互作用,触发下游信号转导过程,进而调控细胞、组织、器官和系统的多种生物学功能。②SphK1/S1P/S1PR2信号通路能调控卫星细胞增殖和成肌细胞分化,改善肌生成。③文章通过文献资料调研法分析了SphK1/S1P/S1PR2信号通路的生理基础以及运动对其影响的可能性。急性有氧运动可提高骨骼肌中SphK1的表达,人体和动物研究中已证实急性和长期运动均可提高骨骼肌中S1P水平,另外研究表明长期抗阻运动可提高S1PR2在骨骼肌中的表达,部分实验结果表明急性和长期运动对肌肉或者血液中S1P水平无显著影响,出现不同结果的原因可能是选择的研究对象、方式、强度及频率不同,而具体机制尚不明确。④研究认为,运动能够促进SphK1/S1P/S1PR2信号通路在骨骼肌中的表达,调控下游相关信号通路,并且针对这一信号通路的研究可能为骨骼肌疾病的治疗提供新的策略和方法,从而改善骨骼肌健康。⑤未来应深化对SphK1/S1P/S1PR2信号通路与骨骼肌健康关联的研究,进一步揭示其与卫星细胞、成肌细胞的调控关系及与上下游通路的相互作用,挖掘其临床应用价值,制定康复方案时考虑该通路变化,探索不同运动对该通路的影响机制,并将其作为潜在治疗靶点,结合人体肌肉模型提升研究深度和准确性。

炙甘草汤通过miR-181a-5p靶向SPHK2调控心肌纤维化改善糖尿病心肌病

目的探究炙甘草汤对糖尿病心肌病(DCM)模型大鼠心肌纤维化的影响以及调控机制。方法雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只,10只大鼠作为对照组;20只通过高糖高脂饮食联合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)构建DCM模型大鼠,造模后按随机数字表法分成DCM组、炙甘草汤组。炙甘草汤组予2 mL/100 g炙甘草汤(1 g/mL)灌胃,对照组及DCM组予等量生理盐水灌胃,连续给药4周,每天1次。灌胃给药结束后,HE染色观察DCM模型大鼠心肌组织的病理改变,Masson染色观察DCM模型大鼠的心肌纤维化情况。提取大鼠乳鼠心肌成纤维细胞,分为对照组、高糖组、炙甘草汤组、miRNA-NC组、miR-181a-5p模拟物组、miR-181a-5p拮抗剂组、炙甘草汤+miRNA-NC组和炙甘草汤+miR-181a-5p拮抗剂组并进行相应处理。通过高糖(30 mmol/L)诱导心肌成纤维细胞增殖模型。蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠心肌组织和心肌成纤维细胞中的α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白(CollagenⅢ)和鞘氨醇激酶2(SPHK2)蛋白表达。实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测miR-181a-5p、CollagenⅠ和CollagenⅢ的相对表达水平。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测心肌成纤维细胞的细胞活力。TargetScan数据库预测miR-181a-5p与SPHK2的结合序列。双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a-5p与SPHK2的靶向关系。结果与对照组比较,DCM组大鼠血糖水平显著升高[(30.40±3.48)mmol/L比(5.08±0.17)mmol/L,P<0.01],心肌细胞肥大、排列紊乱、成纤维细胞增生伴炎症细胞浸润,炙甘草汤组大鼠上述情况均得到改善。与对照组比较,DCM组大鼠心肌组织α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著下降[(0.45±0.20)比(1.00±0.12),P<0.01];而炙甘草汤喂养能够逆转上述表达水平变化。与对照组比较,高糖组心肌成纤维细胞的细胞活力[(194.03±25.59)%比(100.00±11.00)%,P<0.01]、CollagenⅠ[(3.73±0.81)比(1.00±0.17),P<0.01]、CollagenⅢ[(3.93±0.97)比(1.00±0.24),P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著下降[(0.41±0.18)比(1.00±0.21),P<0.01];与高糖组比较,炙甘草汤组心肌成纤维细胞的细胞活力[(147.63±25.80)%比(194.03±25.59)%,P<0.01]、CollagenⅠ[(1.91±0.58)比(3.73±0.81),P<0.01]、CollagenⅢ[(2.02±0.45)比(3.93±0.97),P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平降低,miR-181a-5p水平显著升高[(0.69±0.17)比(0.41±0.18),P<0.01]。与miRNA-NC比较,心肌成纤维细胞转染miR-181a-5p模拟物后miR-181a-5p表达显著升高[(2.82±0.86)比(1.00±0.28),P<0.01],SPHK2表达下降;而转染miR-181a-5p拮抗剂后miR-181a-5p表达显著下降[(0.29±0.09)比(1.00±0.28),P<0.01],SPHK2表达升高。TargetScan数据库分析发现,miR-181a-5p与SPHK2的3’UTR存在结合序列。双荧光素酶报告基因实验证实,miR-181a-5p和SPHK2存在靶向作用。与炙甘草汤+miRNA-NC组比较,炙甘草汤+miR-181a-5p拮抗剂组心肌成纤维细胞CollagenⅠ[(2.95±0.67)比(1.89±0.26),P<0.01]、CollagenⅢ[(2.99±0.74)比(1.85±0.63),P<0.01]、细胞活力[(78.57±10.64)%比(59.75±8.08)%,P<0.01]、α-SMA蛋白、SPHK2蛋白水平升高,miR-181a-5p水平显著降低[(0.77±0.17)比(2.89±0.57),P<0.01]。结论炙甘草汤可能通过miR-181a-5p靶向SPHK2调控心肌纤维化来实现对DCM的改善作用。

吴茱萸碱调节SphK1/S1P信号通路对慢性肾衰竭大鼠肾纤维化的影响

【目的】探讨吴茱萸碱调节鞘氨醇激酶1(SphK1)/S1P信号通路对慢性肾衰竭(CRF)大鼠肾纤维化的影响。【方法】通过饲喂0.5%腺嘌呤饲料建立CRF大鼠模型。将造模后的大鼠随机分为模型组,吴茱萸碱低、高剂量组,尿毒清颗粒组及吴茱萸碱高剂量+K6PC-5(SphK1激活剂)组,另设正常组。干预结束,检测24 h尿蛋白(24 h-UTP)及血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(SCr)水平,酶联免疫吸附分析(ELISA)检测大鼠血清中单核细胞趋化因子1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)水平,苏木素-伊红(HE)染色法、Masson染色法观察肾组织病理学变化并计算胶原容积分数(CVF),实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、Ⅳ型胶原(COL-Ⅳ)mRNA表达,Western Blot法检测肾组织中SphK1、S1P蛋白表达。【结果】与正常组比较,模型组肾组织出现明显炎性浸润及胶原纤维沉积,肾小球数量减少,SCr、BUN、24 h-UTP,IL-6、MCP-1,CVF,TGF-β1、COL-ⅣmRNA,SphK1、S1P表达水平显著增加(P<0.05);与模型组比较,吴茱萸碱低、高剂量组及尿毒清颗粒组肾组织病理改变得到改善,SCr、BUN、24 h-UTP,IL-6、MCP-1,CVF,TGF-β1、COL-ⅣmRNA,SphK1、S1P表达水平显著降低(P<0.05);各指标组间比较,吴茱萸碱低剂量组与吴茱萸碱高剂量组差异有统计学意义(P<0.05),吴茱萸碱高剂量组与尿毒清颗粒差异无统计学意义(P>0.05);与吴茱萸碱高剂量组比较,吴茱萸碱高剂量+K6PC-5组肾组织病理改变进一步加重,各指标的改善作用均被逆转(P<0.05)。【结论】吴茱萸碱可通过抑制SphK1/S1P信号通路改善CRF大鼠肾纤维化。

槐耳多糖调节SPHK1/S1P/S1PR3信号通路对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响

目的:探究槐耳多糖(HP)调节SPHK1/S1P/S1PR3信号通路对宫颈癌细胞恶性生物学行为的影响。方法:MTT检测槐耳多糖(0、25、50、100、200、400μg/mL)处理的宫颈癌细胞活力,筛选最佳药物浓度。实验分为对照组(Control组)、槐耳多糖低、中、高浓度组(HP-L、HP-M、HP-H组)和槐耳多糖高浓度+SphK1激活剂K6PC-5组(HP-H+K6PC-5组),观察细胞增殖、迁移和侵袭情况;western blot检测SPHK1、S1P、S1PR3、Snail、N-cadherin、E-cadherin蛋白水平。结果:处理24、48、72h后,与0μg/mL比较,50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL的HP处理的细胞活力显著降低(P<0.05)。HP-L组、HP-M组和HP-H组细胞Edu阳性率、侵袭细胞数、划痕愈合率及Snail、N-cadherin、SPHK1、S1P、S1PR3水平显著低于Control组(P<0.05),E-cadherin水平显著升高(P<0.05)。HP-H+K6PC-5组细胞Edu阳性率、侵袭细胞数、划痕愈合率及Snail、N-cadherin、SPHK1、S1P、S1PR3水平显著高于HP-H组(P<0.05),E-cadherin水平显著降低(P<0.05)。结论:HP可能通过抑制SPHK1/S1P/S1PR3信号通路抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭和迁移。

基于生物信息学分析SPHK1在胃癌中的表达及临床价值

目的:研究SPHK1在胃癌组织中的表达及利用生物信息学分析其在胃癌中的临床意义。方法:利用HPA和TCGA数据库分析SPHK1在胃癌组织中的表达。采用GEPIA数据库分析SPHK1与MKI67两者在胃癌中表达的关联。基于Kaplan-Meier Plotter数据库分析SPHK1 mRNA表达水平与胃癌患者生存期的关系。基因富集通路预测SPHK1对胃癌潜在的生物学功能。采用TIMER数据库,预测SPHK1在免疫浸润细胞中的表达。通过IHC和Western Blot分析SPHK1在胃癌组织中的表达。结果:生物信息学分析表明SPHK1在胃癌组织中较癌旁高表达(P<0.001)。GEPIA数据库分析显示胃癌组织中SPHK1和MKI67表达较高(P<0.05),且二者呈正相关(P=0.000 49)。Kaplan-Meier Plotter生存分析表明,高表达SPHK1在胃癌中预示更差的总生存期(log rank P=0.002)和进展后生存期(log rank P=0.001 9)。基因富集通路数据显示,SPHK1可能参与多个胃癌进展通路。TIMER数据库分析表明,在巨噬细胞中,低SPHK1表达组胃癌患者的进展后生存期优于SPHK1高表达组(P=0.002)。IHC显示,SPHK1在胃癌组织中的染色强度和阳性面积均高于邻近非肿瘤组织,且染色强度TNMI、Ⅱ期弱于Ⅲ、Ⅳ期。Western Blot显示,在9例胃癌组织及配对癌旁组织中,SPHK1蛋白水平在胃癌组织中表达更高(P=0.026 5)。结论:SPHK1基因在胃癌组织中高表达,并与不良预后相关,且可能降低肿瘤免疫抑制,因而可作为评估胃癌患者预后的潜在标志物。

上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p/Sphk2信号轴促进宫颈癌细胞的机制

目的探讨LncRNA FEZF1-AS1对宫颈癌细胞增殖、侵袭及上皮间充质转化(EMT)的影响及作用机制。方法实时荧光定量PCR分析宫颈癌组织、癌旁正常组织、Hela、H8细胞中LncRNA FEZF1-AS1、miR-363-3p和Sphk2的表达;siRNA FEZF1-AS1转染Hela细胞,MTT、细胞侵袭实验及Western blot检测下调FEZF1-AS1对Hela细胞增殖、侵袭和EMT的影响。miRanda软件分析LncRNA FEZF1-AS1和miR-363-3p之间的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验检测二者的相关性。下调miR-363-3p表达,分析Hela细胞增殖、侵袭和EMT。同时上调LncRNA FEZF1-AS1和miR-363-3p表达,检测LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p对Hela细胞增殖、侵袭和EMT的影响。TargetScan分析miR-363-3p和Sphk2之间的靶向关系,双荧光素酶报告基因实验检测miR-363-3p和Sphk2相关性。siRNA Sphk2转染Hela细胞,检测Hela细胞增殖、侵袭和EMT能力。结果与H8细胞相比,Hela细胞中LncRNA FEZF1-AS1、Sphk2表达上调(P<0.01),miR-363-3p表达下调(P<0.01)。下调LncRNA FEZF1-AS1表达明显抑制了Hela细胞增殖、侵袭与EMT;LncRNA FEZF1-AS1靶向miR-363-3p;下调miR-363-3p促进Hela细胞增殖、侵袭与EMT;上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p促进Hela细胞增殖、侵袭与EMT。miR-363-3p与Sphk2具有靶向关系。下调Sphk2表达抑制了Hela细胞增殖、侵袭与EMT。结论上调LncRNA FEZF1-AS1通过miR-363-3p/Sphk2轴促进Hela细胞增殖、侵袭及其EMT。

SPHK1 expression in gastric cancer and clinical value based on bioinformatics analysis

Objective:To elucidate the expression of SPHK1 in gastric cancer tissues and to analyse its clinical value in gastric cancer using bioinformatics.Methods:The expression of SPHK1 in gastric cancer tissues was analysed using HPA and TCGA databases.The association between the expression of both SPHK1 and MKI67 in gastric cancer was analysed using GEPIA database.Based on Kaplan-Meier Plotter database to analyse the relationship between SPHK1 mRNA expression level and survival of gastric cancer patients.Gene enrichment pathway predicted the potential biological function of SPHK1 on gastric cancer.The TIMER database was used to predict the expression of SPHK1 in immune-infiltrating cells.The expression of SPHK1 in gastric cancer tissues was analysed by IHC and Western Blot.Results:Bioinformatics analysis showed that SPHK1 was highly expressed in gastric cancer tissues compared to paracancerous tissues(P<0.001).The analysis from the GEPIA database reveals a significant increase in the expression of SPHK1 and MKI67 in gastric cancer tissues(P<0.05).Furthermore,there is a positive correlation between the two proteins(P=0.00049).Kaplan-Meier Plotter survival analysis showed that high expression of SPHK1 predicted worse overall survival tine(logrankP=0.002)and post-progression generation time(logrankP=0.0019)in gastric cancer.Gene enrichment pathway results showed that SPHK1 may be involved in multiple gastric cancer progression pathways.TIMER database analysis showed that in macrophages,gastric cancer patients with low SPHK1 expression group had a better post-progression period than those with high SPHK1 expression group(P=0.002).IHC showed that the staining intensity and staining positive area of SPHK1 in gastric cancer tissues were higher than that of adjacent non-tumour tissues.And the staining intensity of TNMI and Ⅱ stages was weaker than that of Ⅲ and Ⅳ stages.Western blot analysis revealed higher levels of SPHK1 protein in gastric cancer tissue compared to paired adjacent non-cancerous tissue in 9 cases(P=0.0265).Conclusion:SPHK1 gene is highly expressed in gastric cancer tissues and is associated with poor prognosis and may reduce tumour immunosuppression,which may serve as a potential marker for evaluating the prognosis of gastric cancer patients.

血根碱调节SphK1/S1P信号通路对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用

目的:探讨血根碱调节SphK1/S1P信号通路对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用。方法:将75只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、血根碱组、PF543组(SphK1抑制剂)、血根碱+PMA(SphK1激活剂)组,每组15只。除假手术组外,其余各组均建立缺血性脑卒大鼠模型。造模后评估各组大鼠神经功能,苏木精—伊红(HE)染色法观察大鼠海马组织病理形态变化。检测大鼠脑组织含水量和脑组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平。采用TTC法检测脑梗死面积,TUNEL法检测神经元凋亡率,蛋白质免疫印迹(western blotting)法检测Bax、Bcl-2、SphK1蛋白表达。结果:模型组大鼠海马神经元严重损伤,大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、MDA水平、Bax、SphK1蛋白表达水平、脑梗死面积、神经元凋亡率显著升高,脑组织SOD、CAT活性、Bcl-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05);血根碱组和PF543组大鼠神经功能缺损评分、脑组织含水量、MDA水平、Bax、SphK1蛋白表达水平、脑梗死面积、神经元凋亡率显著降低,脑组织SOD、CAT活性、Bcl-2蛋白水平显著升高(P<0.05)。SphK1激活剂PMA可部分逆转血根碱对大鼠的保护作用。结论:血根碱可能通过抑制氧化应激和神经元凋亡,阻断SphK1/S1P信号通路,对缺血性脑卒中大鼠发挥神经保护作用。

SphK1-S1P信号通路的激活参与糖尿病大鼠肾损伤的研究

目的观察鞘氨醇激酶1-1-磷酸鞘氨醇(SphK1-S1P)信号通路在链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠肾脏中的激活情况。方法观察STZ诱导的糖尿病大鼠肾脏中SphK1-S1P信号通路的激活情况。分别检测大鼠肾脏功能及病理指标。采用液质联用分析SphK1活性及S1P含量。并采用免疫组织化学、Real-time PCR和Western blot法检测了SphK1的表达。结果 STZ诱导的糖尿病大鼠血糖、肾重体质量比、24h尿蛋白显著升高,糖尿病大鼠肾脏系膜区肥大,细胞外基质扩展。同时,糖尿病大鼠肾脏中SphK1-S1P信号通路被激活,表现为SphK1表达和活性增加,以及S1P生成增加。结论糖尿病大鼠肾脏中存在SphK1-S1P信号通路的激活,可能参与了糖尿病大鼠肾损伤过程。

瑞舒伐他汀对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中Sphk1/S1P/NF-κB信号通路的影响

目的探讨经氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激后,人脐静脉内皮细胞鞘氨醇激酶(Sphk)1、1-磷酸鞘氨醇(S1P)、基质金属蛋白酶(MMP)-3、核转录因子(NF)-κB p65表达的变化及瑞舒伐他汀(Rt)对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤中Sphk1-S1P信号通路的影响。方法实验分为空白对照组,ox-LDL(50μg/ml)处理组,Rt(0.1、1、10μg/ml)干预组,RT-PCR检测细胞Sphk1、S1P、MMP-3因子水平;Western印迹检测细胞NF-κB p65蛋白表达;观察药物干预后细胞Sphk1、S1P、MMP-3、NF-κB p65因子的变化。MTT检测细胞增殖活性。结果 ox-LDL处理组细胞Sphk1、S1P、NF-κB p65、MMP-3的表达均显著高于空白对照组(P<0.05),Rt各干预组较ox-LDL处理组降低(P<0.05)。ox-LDL处理组细胞增殖明显受抑制,Rt各干预组细胞增殖率均较ox-LDL处理组显著上升(P<0.001)。结论 Sphk1-S1P信号传导通路的激活,导致下游炎症因子NF-κB p65、MMP-3的高表达,参与ox-LDL诱导的内皮细胞损伤过程,Rt可能通过抑制Sphk1/S1P信号传导通路介导的与炎症有关的血管损伤,延缓动脉粥样硬化的进程。

吡非尼酮与槲皮素通过S1P/SPHK信号通路抗小鼠肺纤维化比较研究

目的:探讨比较吡非尼酮与槲皮素两药对肺间质纤维化的治疗作用以及与S1P/SPHK信号通路的相关性。方法:本课题组通过建立IPF动物模型,将小鼠分为模型组、对照组、吡非尼酮组、槲皮素组,对小鼠肺间质纤维化模型进行病理学观察,运用Real-time PCR检测小鼠肺组织中SphK1mRNA表达水平,Western-blot法检测小鼠肺组织中纤维化相关蛋白FN、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ和SphK1蛋白表达水平,ELISA法检测小鼠血清和肺组织中S1P表达水平。结果:吡非尼酮与槲皮素均可以减轻博来霉素致小鼠肺纤维化损伤,有效抑制肺纤维化相关蛋白FN,α-SMA,Collagen I,的表达水平,抑制S1P、SphK1表达。结论:吡非尼酮与槲皮素均可以通过调节S1P/SphK1信号通路发挥治疗改善小鼠肺纤维化的作用,两者比较无显著性差别。

Sphk1基因对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响

目的通过抑制鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase-1,Sphk1)基因表达,观察其对人乳腺癌MCF-7细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响。方法使用脂质体2000将化学合成的靶向Sphk1基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转入人乳腺癌MCF-7细胞。使用流式细胞术(FCM)检测转染效率,荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)和Western blot法检测Sphk1的mRNA和蛋白表达水平。利用CCK-8法检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞凋亡,Transwell小室法检测细胞迁移能力。结果 Sphk1 siRNA转染效率达89%。转染siRNA后,MCF-7细胞的Sphk1 mRNA和蛋白表达水平均明显下降,以siRNA-2效果最为显著(P<0.01)。转染Sphk1 siRNA-2后,MCF-7细胞的增殖和迁移能力明显下降,凋亡细胞比例增加,以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论干扰Sphk1基因表达可有效抑制MCF-7细胞的增殖、迁移能力,同时诱导细胞发生凋亡,Sphk1基因可能成为一个潜在的乳腺癌治疗靶标。

肾炎防衰液通过SPHK1/S1P信号通路对糖尿病肾病大鼠肾脏炎症的干预作用

目的:探讨肾炎防衰液通过鞘氨醇激酶1-1磷酸鞘氨醇(SPHK1/S1P)信号通路对糖尿病肾病大鼠肾脏炎症的干预作用。方法:采用单侧肾切除+高脂饲养喂养+链脲佐菌素(STZ)"三联"造模方法构建糖尿病肾病大鼠模型,模型组分别予肾炎防衰液和厄贝沙坦治疗8周,测定24 h尿蛋白定量及血生化指标,检测肾脏Sph K1、S1p2、TNF-α、NF-κBp65表达水平的变化。结果:肾炎防衰液可以降低DKD大鼠24 h尿蛋白定量(P<0.01),减少DKD肾组织Sph K1、S1p2、TNF-α、NF-κBp65mRNA表达(P<0.05),降低Sph K1、p NF-κBp65的蛋白表达。结论:肾炎防衰液可通过抑制Sph K1/S1P信号通路的表达,减轻肾脏炎症反应,对糖尿病肾病大鼠肾脏起到一定的保护作用。

和血柔肝方对肝纤维化大鼠SphK1/S1P/S1PR信号通路的影响

目的观察和血柔肝方对肝纤维化大鼠SphK1/S1P/S1PR信号通路相关因子表达的影响,探讨其治疗肝纤维化的作用机制。方法SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组和造模组,造模组大鼠每周2次颈背部皮下注射60%CCl4溶液(CCl4∶橄榄油=3∶2),剂量3 mL/kg,连续12周,复制肝纤维化大鼠模型。造模成功后,将造模组大鼠随机分为模型组、秋水仙碱组及和血柔肝方低、中、高剂量组,每组10只。各给药组分别予相应药液灌胃,对照组和模型组予等体积蒸馏水,每日1次,连续4周。给药结束后分别检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST),HE染色观察大鼠肝组织病理变化,RT-PCR检测大鼠肝组织鞘氨醇激酶1(SphK1)、1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)、细胞外信号调节激酶1(ERK1)、第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物基因(PTEN)、肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)及转化生长因子-β(TGF-β)mRNA表达,Western blot检测大鼠肝组织SphK1、S1PR3、ERK1、PTEN和TGF-β蛋白表达。结果与对照组比较,模型组大鼠体质量、肝质量、肝系数和脾系数显著降低(P<0.01,P<0.05),血清ALT、AST含量显著增加(P<0.01),肝脏呈深褐色、无光泽,肝体缩小,包膜粗糙,散在大小不等的结节,肝小叶结构破坏,汇管区和中央静脉间有明显桥接纤维间隔形成,并伴有少量炎性细胞浸润,肝组织TGF-β、SphK1、TRAF2、PTEN、ERK1和S1PR3 mRNA表达显著升高(P<0.01,P<0.05),TGF-β、SphK1、PTEN、ERK1、S1PR3蛋白表达显著升高(P<0.01,P<0.05);与模型组比较,各给药组大鼠体质量、肝质量、肝系数、脾质量和脾系数差异无统计学意义(P>0.05),和血柔肝方高剂量组大鼠肝脏形态和肝小叶结构改善,纤维间隔明显减少,炎性细胞浸润减少,和血柔肝方各剂量组大鼠肝组织TGF-β、SphK1、TRAF2、PTEN、ERK1和S1PR3 mRNA表达显著降低(P<0.01),TGF-β、SphK1、PTEN、ERK1、S1PR3蛋白表达显著降低(P<0.01)。结论和血柔肝方可减轻CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏炎症及纤维化状态,尤以和血柔肝方高剂量组疗效显著,其可能通过抑制SphK1/S1P/S1PR信号轴活化状态、减少TGF-β产生,发挥治疗肝纤维化的作用。

SPHK-1在非小细胞肺癌H460细胞耐药株中的作用

目的探讨鞘氨醇激酶-1(SPHK-1)/1-磷酸鞘氨醇(S1P)、NFκB p65信号通路在非小细胞肺癌(NSCLC)耐药细胞中发挥其耐药性的作用。方法建立肺癌耐药细胞株H460/DDP并鉴定其生物学特性,并通过Western blot、RT-PCR实验检测并比较耐药株和亲本细胞中的SPHK-l、S1P及NFκB相关信号蛋白的表达情况。结果成功建立了肺癌耐药细胞株H460/DDP,并对其进行了耐药性评估(IC50H460/DDP=50.62μg/mL,RIH460/DDP=2.95);在药物浓度为10~80μg/mL时,肺癌耐药细胞株H460/DDP的细胞存活率高于肺癌细胞株H460,其差异具有统计学意义(P<0.01);肺癌H460耐药细胞中SPHK-1、S1P及NFκB p65表达水平较亲本细胞明显增高,差异具有统计学意义(P=0.041 5、P=0.046 5、P=0.021 8,P<0.05);且耐药细胞核内NFκB p65蛋白表达也显著增高。结论 SPHK-1/S1P、NFκB p65信号通路在肺癌H460耐药细胞中对发挥其耐药性具有重要作用。

慢性髓系白血病细胞中SphK-1/S1P信号通路的初步研究

慢性髓系白血病(CML)是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。为探讨SphK-1/S1P信号通路元件在CML细胞中的表达情况,研究P210bcr/abl是否涉及到SphK-1/S1P信号通路,首先采用RT-PCR检测bcr/abl阳性的K562细胞和bcr/abl阳性的原代CML细胞中SphK-1和S1P受体mRNA的表达。进一步利用P210bcr/abl特异抑制剂甲磺酸伊马替尼处理bcr/abl阳性的K562细胞和CML原代细胞,然后通过32P-ATP掺入法测定细胞内SphK-1的酶活性。结果表明:K562细胞经2.5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理0.5、2、6、24和48小时后,对SphK-1活性抑制强度分别为0.007%、38.9%、34.6%、28.1%和76.1%;CML原代细胞在使用2.5μmol/L甲磺酸伊马替尼处理后SphK-1活性较对照下降(16.8-41.9)%。结论:CML细胞中存在SphK-1和S1P的表达,P210bcr/abl具有激活SphK-1的作用。

结肠癌手术切除病灶中SphK1、FAK、Musashi 1、CA199表达量与血管新生、上皮间质转化的相关性

目的:探讨结肠癌手术切除病灶中SphK1、FAK、Musashi 1、CA199表达量与血管新生、上皮间质转化的相关性。方法:选择2015年8月~2017年8月间在本院接受根治性手术治疗的结肠癌患者60例,留取术中结肠癌组织标本并作为结肠癌组,留取癌旁正常组织标本作为癌旁组织组。采用荧光定量PCR法检测不同性质结肠组织中SphK1、FAK、Musashi 1、CA199及血管新生、上皮间质转化相关基因的表达量。结果:结肠癌组中SphK1、FAK、Musashi 1、CA199mRNA的表达量均高于癌旁组织组;血管新生相关基因ANGPTL4、Apelin-13、DLL1、VEGF、HIF-αmRNA的表达量高于癌旁组织组,TSP-1mRNA的表达量低于癌旁组织组;上皮间质转化相关基因E-cadherin mRNA的表达量低于癌旁组织组,Vimentin、N-cadherin、Twist、Snail mRNA的表达量高于癌旁组织组。相关性分析发现,结肠癌组织中SphK1、FAK、Musashi 1、CA199表达量与血管新生基因、上皮间质转化基因直接相关。结论:结肠癌组织中存在SphK1、FAK、Musashi 1、CA199基因异常表达,且其表达量与肿瘤血管新生、上皮间质转化进程直接相关。

SphK1信号通路对高糖诱导的系膜细胞FN表达的影响

目的研究阻断鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)通路对高糖诱导的大鼠系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMC)中纤维连接蛋白(fibronectin,FN)表达的抑制作用。方法采用RealtimePCR检测SphK mRNA水平;Western blot检测FN的蛋白表达。结果 SphK1抑制剂二甲基鞘氨醇(N,N-Dimethylsphingosine,DMS)显著降低高糖诱导的FN表达;转染SphK1 siRNA可有效消除高糖诱导的FN上调效应。结论 SphK1通路在高糖诱导的肾小球系膜细胞FN表达过程中发挥着重要的调节作用。