spo0A基因在艰难梭菌生长及芽孢形成中的作用

目的了解spo0A基因对艰难梭菌临床分离株生长和芽孢产生的影响。方法采用ClosTron敲除技术构建艰难梭菌临床分离株C25的spo0A基因突变株,分光光度计检测菌液浓度并绘制生长曲线,孔雀绿染色法计数芽孢和营养细胞。结果艰难梭菌临床分离株C25的spo0A基因敲除突变株和敲除前亲代株的48 h生长曲线无明显差异,但突变株不再产生芽孢。结论 spo0A基因是艰难梭菌芽孢形成过程中的关键基因,但并非其生长过程中的主要基因。

spo0A基因缺失对克劳氏芽孢杆菌发酵生产性能的影响

通过基因敲除的方法构建spo0A基因缺失菌株,并评价spo0A基因缺失对克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)QL-1发酵生产性能的影响。经重叠延伸PCR和基因同源单交换技术,获得spo0A基因缺失突变株B. clausii QL-1△spo0A;通过系统比较spo0A基因敲除前后芽孢生成率、生物量及淀粉酶酶活的改变,发现B. clausii QL-1△spo0A菌株不产芽孢、生物量提高了24%,且B. clausii QL-1△spo0A发酵72 h淀粉酶酶活为1.58×105 U/g,淀粉酶活提高83.72%。说明克劳氏芽孢杆菌spo0A基因缺失对菌体生物量、芽孢生成率及代谢产物的生成等具有重要影响。

spo0A对艰难梭菌毒素A/B蛋白表达的调节作用

目的研究spo0A基因对艰难梭菌毒素A和毒素B蛋白表达的调控作用。方法采用ClosTron基因敲除技术构建艰难梭菌C25菌株spo0A基因突变模型。实时定量反转录PCR方法测不同生长时期(培养后5、12、24、48 h)突变株和亲代株的毒素基因tcdA、tcdB和毒素调控基因tcdC、tcdR、tcdE的表达量,分别用酶联免疫吸附试验(ELISA)和细胞毒中和试验测定细菌培养液中毒素A和毒素B的含量。结果C25菌株spo0A基因突变株在培养5、12、24 h后,其毒素A和毒素B的含量均明显高于亲代株,培养后48 h突变株毒素A含量高于亲代株,毒素B含量与亲代株无明显差异。spo0A基因突变株在培养12、24、48 h后,tcdA、tcdB、tcdE、tcdR基因表达量均高于亲代株;突变菌株tcdC基因的表达无明显高于或低于亲代株。结论spo0A基因对艰难梭菌毒素A和毒素B的表达起负调控作用,其作用可能与抑制tcdE、tcdR基因的表达相关。

短短芽胞杆菌B011基因组中芽胞形成调控基因spo0E的鉴定与表达分析

短短芽胞杆菌B011是一株具有广谱抗菌活性的植物内生菌,发酵后期形成芽胞。据报道,芽胞形成调控基因Spo0E的编码产物能对Spo0A~P蛋白因子去磷酸化,从而实现芽胞形成的负调控。为了能够进一步验证B011基因组中Spo0E基因的功能和表达情况,为B011菌株的遗传改造提供候选基因,本研究基于B011全基因组序列,通过生物信息学工具预测得到了9个spo0E类似基因,并与其他已公布全基因组序列的101个短芽胞杆菌Brevibacillus菌株进行比较,结果表明短短芽胞杆菌spo0E家族基因在物种分化前就已经存在。转录组测序结果表明,FO446_19435和FO446_04050两个spo0E家族基因在B011中高表达,表达模式表现为先升高,在发酵18 h达到最高,此后下降,这两个基因均存在SQELD基序,推测这两个基因为B011中的两个主效spo0E基因。研究结果可为短短芽胞杆菌B011的进一步开发和利用提供一定的基础。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在芽孢形成过程中的几个关键事件

在枯草芽孢杆菌形成芽孢的整个过程中,基因表达的方式主要由Spo0A、σH、σF、σE、σG和σK等因子来控制。不对称分裂(asymmetricdivision)和裹吞作用(engulfment)是芽孢形成过程中经历的两个非常特殊的形态结构变化。各sigma因子出现的时间与地点都与这两个形态结构的变化紧密相连。本文将主要介绍芽孢形成起始点的调控,不对称分裂和裹吞作用发生的机制与σF、σE、σG和σK等sigma因子活化的时间和地点等方面的研究近况。

枯草芽孢杆菌形成芽孢时母细胞中基因表达的调控

枯草芽孢杆菌是典型的模式微生物,其芽孢形成过程一直是细胞分化领域研究的热点,近年来取得了重大进展。其形成芽孢时,细胞进行不对称分裂而产生两个子细胞:前芽孢(forespore)和母细胞(mother cell),它们的基因表达程序是完全不同的,但又相互影响。枯草芽孢杆菌被广泛应用于各种酶的生产,这些酶主要是在母细胞中合成。该文综述了母细胞中基因表达的调控机制。母细胞中基因表达的变化是由母细胞特异性转录因子Spo0A、σE和σK调控的。

纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子的多重PCR鉴定

为建立纳豆芽孢杆菌和嗜酸乳杆菌融合子快速鉴定的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法,根据芽孢杆菌的芽孢形成早期因子基因spo0A和13株乳酸菌β-半乳糖苷酶基因的保守序列分别设计引物对P1/P2和P3/P4,以亲本菌株DNA为模板,优化每对引物在适宜退火温度条件下的PCR体系,在最优体系下的特异性分析结果表明P1/P2能特异性扩增出spo0A基因片段(308 bp),而7株乳酸菌全部呈阴性;P3/P4可扩增出所有受试乳酸菌和经表型鉴定确定的阳性融合子中的目标基因片段(576 bp),而对芽孢杆菌无扩增。多重PCR结果表明在P1/P2的最优体系中只有308 bp片段的扩增,而在P3/P4的最优体系中可实现2个片段的共扩增,对融合后获得的50个菌株的鉴定结果与单重PCR和表型鉴定结果100%吻合。该体系中模板DNA 1 ng/μL,每条引物0.4μmol/L,脱氧核糖核苷三磷酸0.25 mmol/L,Taq酶0.06 U/μL;PCR时94℃预变性5 min;每个循环(共30个)94℃30 s、53℃30 s、72℃60 s,产物末端72℃延伸7 min。该方法简便、快速、特异性好,适用于芽孢杆菌、乳酸菌以及二者融合子的快速鉴定。

同源重组法构建枯草杆菌spo0 A基因缺失突变株

从枯草杆菌(Bacillussubtilis)168的衍生菌株1094的基因组DNA中分别扩增了孢子形成的早期因子基因spo0A的上、下游片段spo0A front和spo0A back,并以大肠杆菌(E.coli)质粒pBluescriptⅡks(+)为骨架,以来自pBEST501质粒上的新霉素抗性基因(neor)为枯草杆菌中的筛选标记,构建了基于枯草杆菌spo0A基因位点的整合载体pYZQ 1.线性化后转化枯草杆菌,从新霉素和壮观霉素双抗性平板上挑取两株转化子,通过基因组的PCR鉴定,孢子形成率测定,孢子染色镜检,确定转化子为枯草杆菌的孢子形成spo0A基因缺失突变株(spo0A∶∶neor).

梭菌芽孢形成的调控机制及应用研究进展

梭菌独特的芽孢形成的特性吸引了越来越多研究者的关注。然而,由于梭菌物种与生理特性的不同,人们会根据不同的需求合理的调控(促进或抑制)芽孢的产生。该文通过对转录调节因子Spo0A,孤儿组氨酸激酶和Sigma因子相关研究进展的介绍,系统阐述了梭菌芽孢形成的分子调控机制,并对梭菌芽孢形成的影响因素进行了概括,同时对近年来通过调控芽孢形成在工业和医疗卫生领域中的应用研究进展进行了介绍,以期为精准调控梭菌芽孢的形成提供可靠的理论参考。

环介导等温扩增技术快速检测食品中的耐热芽孢菌

针对食品中的好热黄无氧芽孢菌、嗜热脂肪地芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌等耐热芽孢菌,以spo0A基因部分序列为靶基因,设计了一套引物,能够同时对这3种菌进行环介导等温扩增(LAMP)检测,扩增只需要60min。该法快速并具有良好的特异性,灵敏度可达到8cfu/mL,是普通PCR的10倍。DNaseI的使用与LAMP结合,可有效降解死菌游离DNA,消除其影响。结果表明,该方法用于奶粉及罐头制品中耐热芽孢菌的检测,具有灵敏度高、特异性强、检测速度快等优点,在食品微生物检测中拥有广阔的前景。

苏云金芽胞杆菌Sigma H对芽胞形成的影响

【目的】检测苏云金芽胞杆菌HD73中的转录调控因子Sigma H(σ~H)对spo0A基因转录的调控作用;异源表达纯化Sigma H蛋白,验证其对spo0A基因启动子的直接结合;检测sigH基因的缺失对苏云金芽胞杆菌HD73芽胞形成和晶体蛋白产生的影响。【方法】通过测定spo0A基因启动子指导的β-半乳糖苷酶活性评价spo0A基因在苏云金芽胞杆菌HD73野生型和sigH缺失突变体中的转录水平;通过PCR扩增苏云金芽胞杆菌HD73的sigH基因并插入到表达载体pET21b上,将质粒转入到表达菌株BL21(DE3)中,得到重组菌株BL21 (pETsigH);利用镍柱亲和纯化和阴离子交换纯化得到纯化的Sigma H蛋白;通过凝胶迁移实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)验证Sigma H蛋白与spo0A基因启动子的直接结合;通过显微镜观察、活芽胞计数的方法对突变株HDΔsigH进行表型特征分析。【结果】sigH缺失后,spo0A基因转录活性降低;在大肠杆菌中正确表达并纯化出大小约为28kDa的Sigma H-His蛋白;EMSA结果表明纯化后的Sigma H-His蛋白可与spo0A基因启动子结合;镜检和活芽胞计数结果表明突变株HDΔsigH无法产生芽胞和蛋白晶体。【结论】Sigma H蛋白通过与spo0A基因启动子结合直接调控spo0A基因的表达且sigH基因的缺失阻断了苏云金芽胞杆菌中芽胞和晶体蛋白的产生。