胸腔积液与外周血ELISPOT检测诊断结核性胸膜炎的效果比较

目的通过比较不同途径的酶联免疫斑点(ELISPOT)检测,探讨其对结核性胸膜炎的诊断价值。方法采用T-Spot-TB试剂盒对164例结核性胸腔积液和102例非结核性胸腔积液患者的外周血和胸腔积液标本进行检测。比较两组的斑点形成细胞数(SFC),采用诊断试验比较胸腔积液与外周血ELISPOT检测诊断结核性胸膜炎的灵敏度及特异度。结果胸腔积液与外周血ELISPOT检测的受试者工作特征曲线下面积分别为0.947和0.905;胸腔积液ELISPOT检测诊断结核性胸膜炎的灵敏度(95.1%)高于外周血(89.0%);特异度(90.2%)也高于外周血(88.2%)。结论胸腔积液较外周血ELISPOT检测具有更高的诊断结核性胸膜炎的价值。

γ-干扰素释放试验联合斑点形成细胞及ELISPOT诊断活动性结核与潜伏性结核的研究

目的:探究γ-干扰素释放试验(interferon-γrelease assays,IGRAs)联合可产生γ-干扰素(interferon-γ,INF-γ)的斑点形成细胞(spot-forming cells,SFC)数量、酶联免疫斑点检测法(enzyme-linked immunospot assay,ELISPOT)模型识别活动性结核与潜伏性结核的诊断效能。方法:选取2017年9月-2018年12月在笔者所在医院就诊的结核分枝杆菌感染患者312例,其中活动性肺结核组154例记为活动组,潜伏性结核分枝杆菌感染158例记为潜伏组。通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析γ-干扰素释放试验、SFC及ELISPOT联合诊断模型识别活动性及潜伏性结核的诊断价值。结果:活动组γ-干扰素释放试验结果高于潜伏组,SFC高于潜伏组,ELISPOT阳性率(78.6%)高于潜伏组(31.0%),差异均有统计学意义(P<0.05)。γ-干扰素释放试验诊断的临界值为2.72 IU/ml,其对应灵敏度为79.1%,特异度为52.5%,ROC曲线下面积为0.768[95%CI(0.708,0.829)];SFC诊断临界值为2.78,其对应的灵敏度为75.3%,特异度为60.8%,ROC曲线下面积为0.768[95%CI(0.711,0.825)];ELISPOT阳性诊断临界值为4.27 mg/L,其对应灵敏度为70.8%,特异度为51.3%,ROC曲线下面积为0.620[95%CI(0.546,0.694)]。行Logistic回归分析,得到联合诊断模型Logit(P)=1.433+2.512γ-干扰素释放试验+1.654 SFC+1.121 ELISPOT,联合检测截断值为2.47,对应灵敏度为74.7%,特异度为80.4%,ROC曲线下面积为0.851[95%CI(0.806,0.896)]。联合检测特异度及曲线下面积均高于各指标单独检测,差异均有统计学意义(P<0.05),且联合检测保持较好的灵敏度。结论:γ-干扰素释放试验、SFC及ELISPOT联合诊断模型可提高活动性结核的特异度,并保持较高的灵敏度,在鉴别活动性及潜伏性结核感染方面具有重要的临床价值。

乙型肝炎疫苗细胞免疫应答检测用参考品的制备和初步应用研究

目的通过研究重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)免疫小鼠诱导细胞免疫应答的特点,制备一批细胞免疫应答检测用参考品,规范乙型肝炎疫苗细胞免疫实验条件和操作。方法背部皮下分别免疫小鼠(BALB/c,H-2d)0.5、1、2、4和8μg的HBsAg,于免后7d,检测小鼠脾单个核细胞(MNC)体外刺激诱生IFN-γ的水平。分别免疫小鼠2、4μgHBsAg,免后7d,检测MNC分泌IFN-γ水平。结果1μg组可检测小鼠IFN-γ阳转;免疫剂量与IFN-γ阳转率存在剂量效应关系(r=0.951,P=0.049),IFN-γSFC与免疫剂量也存在剂量效应关系(r=0.996,P=0.000)。2μgHBsAg组IFN-γ阳转率在50%～75%之间;4μg组IFN-γ阳转率均为75%。结论制备一批乙肝疫苗细胞免疫参考品,用于规范疫苗诱导细胞免疫应答的方法检测。

重组乙型肝炎表面抗原(汉逊酵母菌表达)免疫小鼠后不同细胞免疫测定方法的比较研究

目的探讨不同细胞免疫测定方法对小鼠免疫乙型肝炎表面抗原(HBsAg)后细胞免疫应答测定的影响。方法小鼠皮下接种HBsAg,于免疫后4、7、10、14和25d分离脾单个核细胞(MNC),应用酶联斑点法(ELISPOT)测定MNC细胞体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ斑点形成细胞计数(SFC),其中刺激物选择多肽和HBsAg;流式荧光检测技术(Luminex)测定MNC体外经HBsAg刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-10含量;小鼠血清检测抗-HBs。结果小鼠接种HBsAg后,应用ELISPOT法测定,7d和14d小鼠IFN-γ阳转率分别为60%和80%;而应用Luminex方法测定,7d和14d小鼠IFN-γ阳转率均为80%;IL-4、IL-5、IL-10阳转率分别为60%,80%;100%,100%;80%,100%;25d时,IFN-γ与14d比较统计学上差异有统计学意义(P25,14d=0.030,<0.05),而IL-5、IL-10和IL-4与14d比较差异均无统计学意义(P>0.05)。抗-HBs水平随时间而呈上升趋势。结论Elispot和Luminex法测定小鼠IFN-γ应答符合率高,小鼠接种单针HBsAg后细胞免疫应答高峰为免疫后7～14d。25d时IFN-γ分泌水平随抗-HBs抗体水平升高而下降,而IL-4、IL-5、IL-10分泌继续保持较高水平。

炭疽AVA疫苗特异性抗体分泌细胞检测方法的建立

目的 应用酶联免疫斑点（ELISPOT）技术,建立一种检测炭疽AVA免疫后特异性抗体分泌细胞的方法,用于检测和评价炭疽无菌培养滤液抗原特异性抗体形成细胞的功能.方法 无菌分离小鼠脾细胞,建立一系列特异性ELISPOT检测炭疽无菌培养滤液抗原特异性抗体分泌细胞的参数：包括抗原最佳包被浓度、细胞最适孵育时间、反应体系中细胞浓度以及亲和素抗体工作浓度的确定,同时检测上清中抗体效价,并以不相关抗原包被,检验方法的敏感性和特异性.结果 当抗原包被浓度为7.5μg/mL时,不同细胞浓度反应曲线最稳定 细胞数为5×10^6/mL时,不同包被浓度形成的斑点数适量,易于计数 且在抗体稀释度相同情况下,脾细胞孵育时间为3～6 h所获得的斑点数最清晰,背景着色最浅,容易被仪器识别 同时,特异性抗原包被组所获得的斑点频数高于无关抗原包被组（P＜0.01） 反应体系上清中未检测到抗原特异性抗体.结论 该方法敏感、特异,可用于AVA抗原免疫后体液免疫评价.

T细胞斑点试验辅助诊断不同部位肺外结核感染的应用

目的探讨T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)对不同部位肺外结核的辅助诊断价值。方法选取2011年9月-2012年6月某院诊断为肺外结核的124例患者为观察组,并随机选取同期未合并结核的130例患者作为对照组,评估T-SPOT.TB诊断不同部位肺外结核的敏感度及两组T-SPOT.TB结果斑点数的差异。结果结果T-SPOT.TB诊断观察组的敏感度为81.5%,TST组为65.3%,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);不同部位的结核感染T-SPOT.TB的敏感度不同,淋巴结结核的敏感度最高,为100.0%,其次依次为两处及以上88.6%,肠结核85.7%,骨关节结核83.3%,结核性腹膜炎最低66.7%;无浆膜腔积液的患者T-SPOT.TB的敏感度88.5%,有浆膜腔积液的患者为74.6%,免疫抑制患者的T-SPOT.TB敏感度68.8%,免疫正常患者为85.9%,两者比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 T-SPOT.TB对肺外结核的诊断价值随肺外结核感染部位不同而改变,其诊断敏感度与有无浆膜腔积液、机体免疫状态有关。

成人接种乙型肝炎疫苗后细胞免疫应答的动态变化

目的探讨人体接种乙型肝炎（乙肝）疫苗后细胞免疫的动态变化,了解疫苗介导的细胞免疫应答与体液免疫应答的关联。方法8例成人按0、1、2月程序接种乙肝疫苗,于首针免疫后3、8、21、34和65 d采静脉血,分离外周血单个核细胞（PBMC）,对PBMC进行细胞分选,获得纯度95%以上的CIM^＋和CD8^＋ T淋巴细胞,应用酶联免疫斑点法（ELISPOT）测定PBMC、CD4^＋和CD8^＋ T淋巴细胞体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-2和IL-4的斑点数（SFC）,并收集乙肝疫苗免疫前（0 d）和免疫后3、8、21、30、34、60、65和150 d血样,测定乙肝表面抗体（抗-HBs）。同时设立阴、阳性对照各2例。结果人接种乙肝疫苗后,CD4^＋、CD8^＋ T淋巴细胞产生不同细胞因子趋势和强度不同： IFN-γ（由CD8^＋、CIM^＋ T淋巴细胞产生）出现较早,且较为稳定,而CD4^＋ T淋巴细胞产生的IL-2和IL-4出现较晚,但其升高与第2、3针乙肝疫苗免疫有关;免疫后IL-4阳转率与抗-HBs阳转率呈显著正相关,IL-2、IL-4的SFC与抗-HBs滴度也呈显著正相关。结论成人接种乙肝疫苗后可早期检测出以IFN-γ为主的细胞免疫,IL-4和IL-2阳转与抗-HBs升高有关。

不同种类乙型肝炎重组疫苗诱导免疫应答特点比较

目的比较三种乙型肝炎重组疫苗（rHB）[乙型肝炎汉逊酵母重组疫苗（rHP）、酿酒酵母重组疫苗（rSC）和CHO重组疫苗（rCHO）]诱导小鼠细胞和体液免疫应答特点。方法给3组小鼠（BALB／c，H-2d）分别皮下接种3种rHB3弘g，于免疫后第4、7、10、14、25和35d分离脾单个核细胞（MNC），应用酶联斑点法（ELISPOT）测定MNCs体外刺激后所产生的细胞因子IFN-γ、IL-2斑点形成细胞数（SFC）。刺激物为多肽或HBsAg。同时测定免疫后不同时间的细胞毒T淋巴细胞反应（CTL）活性和小鼠血清抗-HBs水平。结果应用ELISPOT法，不同种类rHB免疫小鼠后诱导分泌IFN-γ和IL-2峰值均为10—14d；rHP诱导CTL活性（P=0．000〈0．05）和分泌IFN，7水平（P〈0．05）均显著高于rCHO和rSC，且rHP于免疫后第10天诱导CTL杀伤率最高（39．8％）；rHP组诱导分泌IL-2水平均显著高于其他两种疫苗组（P〈0．05），第7和14天时，rSC组诱导产生IL-2水平均显著高于rCHO组（第7天t=4．595，P=0．001〈0．05；第14天t=5．721，P=0．000〈0、05）；免疫后第7天3种疫苗诱导细胞免疫应答强度依次为rHP最强，rSC其次，rCHO最弱；小鼠血清抗-Ugs阳转率和抗体滴度随免疫时间而逐渐上升，第7天时rCHO组抗体显著高于rHP组（P=0．044〈0．05），第14天时rCHO组抗体显著高于rHP组（P=0．009〈0．05）和rSC组（P=0．012〈0．05）。结论3种疫苗免疫小鼠的应答特点不同，酵母重组疫苗早期诱导细胞免疫应答优于rCHO；rCHO的优势是诱导产生抗-HBs早，且滴度较高。

结核感染T细胞斑点试验在监测脊柱结核治疗效果中的应用价值

目的应用结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)监测脊柱结核治疗效果(手术疗效和抗结核治疗效果),进一步探讨其应用价值。方法选取2015年1月-2017年10月脊柱结核感染患者42例,抽取受试者外周静脉血,应用T-SPOT.TB技术,使用结核分枝杆菌特异性融合抗原早期分泌性抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)作为刺激物进行检测,并详细记录患者基本资料信息,动态分析患者入院时、手术前1 d、手术后1 d和术后12个月的T-SPOT.TB结果。结果 42例患者均接受手术治疗,T-SPOT.TB在脊柱结核入院时的诊断阳性率为83.3%(35/42),7例脊柱结核患者T-SPOT.TB结果呈假阴性改变。患者入院时、手术前1 d、手术后1 d及术后12个月ESAT-6对应的斑点形成细胞(SFC)数量分别为(34.1±20.8)、(33.8±20.9)、(31.2±18.7)、(17.9±13.8)个;CFP-10对应的SFC数目分别为(51.5±45.7)、(49.7±44.7)、(47.8±43.1)、(26.5±23.4)个。经过配对样本t检验,术后12个月和入院时比较ESAT-6和CFP-10刺激形成的SFC数量显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。其中31例(73.8%)患者ESAT-6对应的SFC数目下降,33例(78.6%)患者CFP-10对应的SFC数目下降。结论脊柱结核患者经过外科病灶清除术加上12个月抗结核治疗后,T-SPOT.TB定量结果(SFC数量)较术前明显下降,可为监测脊柱结核患者治疗效果提供一定价值。

结核感染T细胞斑点试验的临床应用价值探讨

目的探讨结核感染T细胞斑点试验(T-spot assay.tubercle bacillus,T-SPOT.TB)在肺结核诊断中的临床意义及斑点形成细胞数的参考价值。方法应用结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)检测方法对210例2017年1~12月期间入住某院且临床已诊断肺结核病例(结核病组)和非结核疾病的其他肺部疾病病例(非结核疾病组)66例血液标本进行检测并分析结果。结果以临床诊断为标准,T-SPOT.TB试验敏感度为84.29%(177/210);特异度为78.79%(52/66)。肺结核组斑点形成细胞数(SFC)为(44.80±61.51)(结核特异的混合抗原A,ESAT-6抗原)和(54.97±80.59)(结核特异的混合抗原B,CFP-10抗原);非结核疾病的其他肺部疾病组斑点形成细胞数为(2.71±3.77)(ESAT-6抗原)和(2.55±4.05)(CFP-10抗原),两组结果差异有统计学意义[t=-5.55,P=0.000(A)及t=-5.28,P=0.005(B)]。T-SPOT.TB阳性的肺结核组SFCs为(52.70±63.97)(ESAT-6抗原)和(64.64±84.34)(CFP-10抗原),而T-SPOT.TB阳性的其他肺部疾病组SFCs为(7.00±5.35)(ESAT-6抗原)和(7.71±6.12)(CFP-10抗原),两组差异有统计学意义[t=-2.666,P=0.001(A)及t=-2.519,P=0.000(B)]。T-SPOT.TB阴性的肺结核组SFCs为(2.42±2.00)(ESAT-6抗原),而其他肺部疾病组SFCs为(1.56±2.10)(ESAT-6抗原),两组差异无统计学意义[t=-1.888,P=0.888(A)]。结论 T-SPOT.TB斑点形成数在肺结核诊断中有一定的参考价值,在临床实践中应高度重视斑点形成细胞数高值的受检者,尽早采取防治措施。