诱导型成骨细胞特异Stat3基因敲除小鼠的构建及验证

目的:运用Cre-Loxp基因敲除系统,构建诱导型条件性Stat3基因敲除小鼠并验证其敲除效率。方法:通过Stat3fl/fl与Col1 creERT2基因型的C57小鼠多代杂交,构建诱导型成骨细胞特异Stat3敲除小鼠Stat3Col1ERT2。取其骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs),加入4-羟基他莫西芬(4-OTH)后,采用实时定量PCR技术和免疫印迹技术在m RNA与蛋白水平分别体外验证Stat3敲除效果。于小鼠腹腔注射他莫昔芬,采用免疫荧光染色技术,观察小鼠上颌牙槽骨区域STAT3的表达,以体内验证敲除效果。采用SPSS 24.0软件包对数据进行统计学分析。结果:实时定量PCR和免疫印迹结果显示,Stat3Col1ERT2小鼠BMSCs体外加药诱导敲除后,STAT3的m RNA水平显著下调(P<0.05)、蛋白表达降低(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,Stat3Col1ERT2小鼠体内上颌牙槽骨区域成骨细胞的STAT3表达显著降低(P<0.05)。结论:本研究成功构建了诱导型成骨细胞特异Stat3基因敲除小鼠,使基因敲除可受观察者时空调控,为今后正畸牙移动、颌骨牵引成骨、颌骨骨折等牙槽骨改建机制的研究提供了新的思路及依据。

EZH2基因敲除对局灶节段性肾小球硬化小鼠足细胞损伤和JAK2/STAT3信号通路的影响

目的 探讨EZH2基因敲除对局灶节段性肾小球硬化(FSGS)模型小鼠肾脏足细胞损伤和JAK2/STAT3信号通路的影响。方法 将60只Cas9小鼠随机分为EZH2敲除组和EZH2未敲除组,每组30只。EZH2敲除组小鼠肾静脉注射重组腺病毒(AAV9-sgRNA-EZH2),EZH2未敲除组小鼠肾静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS),且2组小鼠均单次尾静脉注射阿霉素,分别建立EZH2敲除FSGS模型和EZH2未敲除FSGS模型。采用苏木素-伊红(HE)染色法观察2组小鼠肾组织病理变化;采用双重免疫荧光染色法观察2组小鼠足细胞nephrin、podocin表达情况;采用TUNEL法检测2组小鼠足细胞凋亡指数;采用免疫印迹(Western blot)法检测2组小鼠肾组织JAK2、STAT3蛋白表达水平。结果 与EZH2未敲除组FSGS小鼠相比,EZH2敲除组FSGS小鼠肾小球病变更严重,足突广泛融合,肾小球基底膜明显增厚,系膜基质增多,毛细血管闭塞。与EZH2未敲除组FSGS小鼠相比,EZH2敲除组FSGS小鼠足细胞nephrin、podocin表达减少,差异有统计学意义(P<0.01)。EZH2敲除组足细胞凋亡指数为(40.94±2.13)%,高于EZH2未敲除组的(21.23±3.30)%,差异有统计学意义(P<0.01)。EZH2敲除组FSGS小鼠JAK2、STAT3蛋白表达水平依次为(2.67±0.41)、(2.37±0.53),分别高于EZH2未敲除组的(1.72±0.31)、(1.70±0.48),差异有统计学意义(P<0.01)。结论 EZH2基因敲除可能参与JAK2/STAT3信号通路的激活,并加重FSGS小鼠肾脏足细胞损伤。

Stat3的功能多样性

Stat3为信号转导与转录激活因子(signal transducers and activators of transcription,STAT)蛋白家族的成员,在维持胚胎干细胞的全能性及调节免疫中发挥重要作用。Stat3基因敲除的小鼠可引起胚胎致死,其异常表达与多种疾病密切相关。精确的认识Stat3在不同组织和细胞中的功能有助于我们了解Stat3在疾病发生中的作用。汇总了近年来对Stat3不同位点氨基酸的功能和修饰研究,以及不同组织中Stat3条件型敲除小鼠中的研究进展,并从这两个方面阐明Stat3的功能多样性。