Streptomyces lavendulae X33海藻糖合酶基因克隆及酶学特性

【目的】海藻糖是一种由2个葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷键连接的非还原性双糖,在生物制品的保护剂方面具有良好的应用前景。海藻糖合酶(Trehalose Synthase,EC.5.4.99.16)可通过转糖苷作用将麦芽糖转化成为海藻糖,该反应仅需一步,且所用原料低廉,在酶法生产海藻糖上显示出一定的应用潜力。对链霉菌Streptomyces lavendulae X33中编码海藻糖合成酶的基因SlTs进行克隆,通过原核表达获得重组海藻糖合成酶,并研究其酶学性质。【方法】以Streptomyces lavendulae X33基因组DNA为模板,使用加尾PCR的方法克隆编码海藻糖合成酶的基因,构建含有组氨酸标签的重组表达载体,并将重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达。重组蛋白经Ni-NTA纯化,以麦芽糖为底物研究其酶学性质,包括最适温度、最适pH和pH稳定性及金属离子和抑制剂的影响。【结果】从菌株Streptomyces lavendulae X33基因组中克隆得到了海藻糖合成酶基因片段SlTs GenBank登录号为MW217513。SlTs全长1719 bp,编码一个572个氨基酸的蛋白SlTs,分子量大小为66 ku。氨基酸序列分析表明SlTs与来源于Thermomonospora curvata DSM 43183的海藻糖合酶最高相似性为84%,与其它已报道的海藻糖合酶有较大差异。序列比对的结果显示SlTs与已解析结构的海藻糖合酶TcTs(PDB.5h2t)等具有的基序“DGGYD”“NHTS”“QPDLN”“RXDAVPYL”“LLAEANQ”“LRNHDELTLE”高度保守,具有一个由Asp218-Glu260-Asp330构成的活性中心,表明SlTs归属于糖苷水解酶GH13家族。经异源表达,Ni^(2+)-NTA亲合层析后进行纯化。重组酶rSlTs最适反应温度为20℃,最适反应pH为7.5,在以麦芽糖为底物,最适反应条件下测得的比活力为67.6 U/mg。重组酶rSITs在20℃下处理1 h活力不变,处理9 h时,残留酶活为60%。但在50℃下处理0.5 h活力丧失,表明rSITs对热敏感。重组酶rSITs在pH5.0-8.0有活性,最适反应pH为6.0,在pH6.0-7.0处理12 h活力稳定。1 mmol/L Ca^(2+)对重组酶rSlTs有激活作用,Ni^(2+)、Zn^(2+)、Cu^(2+)对重组酶rSlTs有抑制作用,其余金属离子对酶活无影响。甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂和SDS对重组酶rSlTs有显著抑制作用,TritonX-100对酶活无显著影响。【结论】首次从Streptomyces lavendulae X33中克隆得到海藻糖合成酶,并对其进行了酶学性质研究,为开发新的海藻糖合成酶提供理论基础。