玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗南方根结线虫相关酶活性及其防效

根据雌虫会阴花纹特征将采集地河北省定州市西南合村黄瓜棚的根结线虫鉴定为南方根结线虫,并研究对多种植物病原菌具有较强抑制作用的玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63对南方根结线虫的防效及其产生的与防治线虫相关的酶。结果表明,Men-myco-93-63发酵液对根结线虫二龄幼虫的校正致死率达到100%,粗酶液对线虫的校正致死率达到94.87%。Men-myco-93-63具有较强的胶原蛋白酶产生能力,也可产生丝氨酸蛋白酶和蛋白酶,发酵液中蛋白酶的活力达到473.363 7U/mL。推测胶原蛋白酶、蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等酶类在该生防菌对南方根结线虫的防治中起重要作用。温室盆栽试验结果表明,玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63发酵液及其固体发酵物对根结线虫均有防效;其中,发酵液5倍稀释液对根结线虫的防效最好,达到39.99%。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63发酵液对黄瓜白粉病抗性的影响

药效试验表明,玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63发酵液对黄瓜白粉病有良好的防效,其中发酵液保护作用的防效为88.63%,治疗作用的防效为82.26%,表明该发酵液对黄瓜白粉病的防治既有保护作用又有治疗作用。通过对喷施发酵液后黄瓜叶片内的抗病相关酶的活性的测定发现,喷施Men-myco-93-63发酵液后黄瓜叶片内POD,CAT,PAL,PPO等酶的活性在一定时间内有明显上升的趋势。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63营养型片剂的研制及应用

为了研制出一种防治棉花黄萎病的玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63营养型片剂,本试验利用单因素和双因素方差分析法筛选其氮源、碳源和粘合剂,并在田间试验评价该片剂对棉花黄萎病的防效。结果表明:片剂中载体硅藻土与玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63种子液最适质量体积比为2∶1,碳源为蔗糖,浓度15%;氮源为花生饼粉,浓度为15%;粘合剂聚乙二醇6000或玉米淀粉。制备的片剂重量差异符合标准,含菌量3×107cfu/g,含水量2%,杂菌率为1%,4℃真空条件下保存120d,菌含量仍能达到2×105 cfu/g。Men-myco-93-63片剂1.0g/株对棉花黄萎病的防效达到88.66%,皮棉产量达到2245.50kg/km2,明显优于其它对照药剂。生物农药片剂作为一种新农药剂型,具有很高的应用潜力。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63负调控基因nsdAmgh的克隆及序列分析

nsdA(Negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因。根据天蓝色链霉菌A3(2)的序列设计引物扩增玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63菌株中的该基因,经测序和序列分析表明,由保守序列引物nsdA-2R和nsdA-2L克隆到的Men-myco-93-63菌株中的该基因800 bp片段与已知nsdA基因核苷酸保守区域序列同源性达到99%,由全长序列扩增引物nsdA WZ-R和nsdA WZ-L克隆到的该基因包含一个完整的开放阅读框,共编码369个氨基酸,与变铅青链霉菌和天蓝色链霉菌A3(2)中的nsdA基因的核苷酸序列同源性达到100%,氨基酸序列同源性达到99%。该全长基因命名为nsdAmgh,其在玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中的发现为阻断该负调控基因以期获得抗生素高产工程菌株提供了重要依据。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63发酵液防治黄瓜白粉病的作用机理研究

利用透射电镜技术与细胞学相结合的方法探索了Men-myco-93-63发酵液对黄瓜白粉病菌的作用位点,揭示了白粉菌以及寄主细胞在超微结构上发生的变化。利用扫描电镜技术研究了处理前后黄瓜白粉病菌孢子萌发率、菌丝的生长、产孢时间。结果表明:利用透射电镜观察超微结构表明,寄主细胞对病原菌的侵入产生了防卫反应结构,表现为寄主细胞壁加厚,染色加深,在寄主细胞壁下产生结构致密的乳突,在寄主细胞壁与质膜之间有黑色沉积物质。黄瓜白粉菌产生吸器的数目明显减少,吸器畸形,吸器壁增厚,细胞器泡囊化解体,最终吸器坏死,不能从寄主细胞中更好地吸取营养,达到防病的目的。利用扫描电镜观察表明,Men-myco-93-63发酵液使白粉菌的孢子萌发率降低31.51%,在一定程度上抑制了菌丝的生长,寄主体表的菌丝形态表现为菌丝扭曲变形,菌落稀疏变小,延迟其产孢时间约2 d。Men-myco-93-63发酵液能通过直接对菌体作用达到防治黄瓜白粉病的目的。

生防菌株Men-myco-93-63液体培养代谢特性初探

1 材料和方法 1．1 供试菌株链霉菌Men-myco-93-63,由河北农业大学植物病害生物防治研究室提供。 1．2 培养基和培养方法 1．2．1 培养基发酵培养基:3％淀粉,1％葡萄糖,2％蔗糖,0．02％果糖,2．0％花生饼粉,0．5％ NaCl,0．2％酵母膏,0．6％(NH4)2SO4,0．02％ KH2P04,0．25％CaCO3,0．07％FeSO4,0．07％ ZnSO4pH自然。 1．2．2 培养方法每100 mL培养基接种1 mL 孢子悬液(浓度107数量级),装入500 mL三角瓶, 30℃,200 r/min振荡培养,每12 h取样检测代谢情况。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdA_(mgh)基因的验证

玫瑰黄链霉菌(Streptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63是分离自马铃薯疮痂病自然衰退土壤中的一株拮抗菌。该菌株及其发酵液对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae)等多种重要的植物病原真菌都具有较强的抑制作用。nsdA(negative regulator of Streptomyces differentiation)基因是从天蓝色链霉菌中发现的与抗生素合成相关的负调控基因。根据天蓝色链霉菌A3(2)的序列设计引物,PCR扩增出Men-myco-93-63nsdAmgh基因,经斑点杂交法验证,nsdAmgh确实在该生防菌中存在。该基因的发现有助于进一步了解该生防菌产生抗生素调节的分子机制,也为抗生素高产菌株的获得提供了新的靶标。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63固体发酵培养基的优化

研究玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63固体发酵培养基优化条件。采用单因素试验筛选的适宜得到固体基质为硅藻土,m(硅藻土)∶V(种子液)=2∶1,对菌落形成单位数有影响的因素为葡萄糖、蛋白胨、复合维生素和复合微量元素。在此基础上,通过响应面法对4个因素的组合进行优化,优化后这4个因素的质量分数最佳组合为葡萄糖2.2%、蛋白胨0.7%、复合维生素1.0‰、复合微量元素1×10-5。在此条件下,菌落形成单位数有了很大提高,达到1.7×108cfu/g。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63原生质体形成和再生条件的初探

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63在温室及大田试验中都对棉花黄萎病菌表现出很强的拮抗作用,是一株很有应用潜力的生防菌株。不论是菌丝体本身还是其代谢产物都对多种植物病原菌有很强的抑制作用。对该生防菌株进行深入研究,尤其是分子水平的研究尤为重要。笔者通过研究影响链霉菌原生质体形成的多种条件和因素,包括培养基的选择、培养时间、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度、酶解时间等,最终成功的制备出了生防菌Men-myco-93-63的原生质体,初步确定了其形成条件:TSB培养基一级培养24h,用SGGP作为二级培养基培养菌丝体40h(补加甘氨酸2%),将菌丝体加入2mg/ml溶菌酶37℃水浴60min后即可得到原生质体,涂在再生培养基R5上再生培养,再生数可达4.8×106个/ml。为该生防菌原生质体的转化、基因表达等研究奠定了重要的基础。

链霉菌Men-myco-93-63固体发酵的初步研究

试验对链霉菌Men-myco-93-63固体发酵的培养基和培养条件进行了研究。以产孢量为指标,通过单一固体基质筛选、组合固体基质筛选及正交试验得到适宜链霉菌Men-myco-93-63产孢的固体培养基是大米:高粱:米糠:稻壳为2:2:3:3(W/W/W/W),试验中产孢量最高达到2.52×109CFU/g。在此培养基的基础上研究了装料量、初始水料比、接种量和培养温度对其产孢的影响。结果表明,链霉菌Men-myco-93-63产孢的适宜条件为:装料量为15g/500mL三角瓶,初始水料比为1.7:1.0(V/W,不计稻壳质量),液体接种量为7mL,培养温度为28℃。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗生素的提取和薄层分析

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是一株对多种植物病原真菌和细菌具有很强拮抗作用的生防链霉菌,本文对该菌株在燕麦液体培养基、改良4号培养基和MM培养基中的发酵粗提抗生素进行了分析,结果表明燕麦液体培养基中菌体生长量大,萃取获得的粗提抗生素较多,是理想的发酵培养基。薄层分析表明,甲醇∶氯仿为1∶6时是抗生素的最佳层析展开剂,层析可获得7个活性组分,其中组分Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ对马铃薯疮痂病菌具有抑菌活性。另外,组分Ⅶ还对棉花黄萎病菌有较强的抑菌活性。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63抗逆性的初步研究

通过平板培养测定菌落形成单位数（cfu值），研究玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63的抗逆性。结果表明：菌株在pH 5-11范围内均可生长，pH 6-9为适宜菌株生长的范围；该菌株有较强的耐盐性，0.4%-0.8%NaCl对菌株的生长有一定的促进作用；40℃和50℃处理10-60 min对孢子的存活影响较小，55℃处理30-60min和60℃处理10-60 min对孢子的存活影响较大；玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63与80%多菌灵、10%吡虫啉相容性较好，两种农药对菌株的EC50分别为2.31 mg/mL和8.82 mg/mL，而菌株与70%甲基托布津、4.5%高效氯氰菊酯和10%苯醚甲环唑相容性较差，EC50分别为0.25、0.10、0.86 mg/mL。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性成分的初步研究

对拮抗链霉菌Men-myco-93-63固体培养基中活性成分的提取分离进行了初步研究,最后确定乙酸乙酯与丙酮3∶1(V/V)的混合提取剂为最佳提取剂,并明确了该活性成分属于脂溶性。进行了活性成分存在部位的测定试验,结果发现活性成分既存在于菌丝体中,又存在于培养基中。通过HPLC对活性成分进行检测,确定了其中能够进行纯化的组分。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63 nsdA_(mgh)基因阻断突变株的构建

为研究从玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中克隆到的,与天蓝色链霉菌M 145中的一个重要负调控基因nsd A基因同源的nsdA_(mgh)基因的功能,本文构建了nsd A_(mgh)基因破坏型重组质粒pSRNA2500(pKC1139::1.5 kb nsdA_(mgh)::1.0 kb Km^r),转化ET12567(pUZ8002)获得接合转移供体菌ET12567(pUZ8002,pSRNA2500),通过接合转移将重组质粒导入玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63中。在高温和抗生素双重筛选压力下,筛选得到表型为Am^sKm^r的nsd A_(mgh)基因阻断突变株,通过PCR、Dot bloting和Southern blotting验证了突变株中的nsdA_(mgh)基因已被正确阻断。与出发菌株相比,突变株在摇瓶水平上对棉花黄萎病菌的抑制能力提高了一倍。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性代谢产物roflamycoin的光稳定性分析

为研究影响玫瑰黄链霉菌Streptomyces roseoflavus Men-myco-93-63活性代谢产物roflamycoin光不稳定的因素,采用高效液相色谱仪测定了不同光照环境、光照强度、光照时间、溶剂、质量浓度等因素下roflamycoin的光分解率;检测8种光稳定剂对roflamycoin光分解的抑制作用;并通过抑菌圈法测定了光分解前后物质抑菌效果的变化。结果显示,在roflamycoin的光分解过程中,太阳光和日光灯是其敏感光源,而紫外光并不能引起光分解;光照强度越大、光照时间越长、质量浓度越低,其光分解速率越快;在甲醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃5种溶剂中的光分解速率无显著差异;roflamycoin光分解过程最终可以达到一个稳定状态,主要分解为3种物质,并与roflamycoin具有相同的五烯大环内酯骨架;8种光稳定剂均未表现出抑制光分解的作用。roflamycoin光照分解后对12种病原菌仍有抑制作用,其中对番茄灰霉病菌、玉米穗腐病菌等6种病原菌的抑制活性显著增强,抑菌圈直径增大7.64%～21.91%,对棉花黄萎病菌、苹果斑点落叶病菌等4种病原菌的抑制活性显著降低,抑菌圈直径减小10.03%～91.46%。推测roflamycoin的光分解产物仍具有抑菌活性。

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63胞外分泌蛋白对黄瓜白粉病的诱导抗性初报

为了明确玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63胞外分泌蛋白是否可诱导对黄瓜白粉病的抗病性,通过硫酸铵沉淀的方法,从Men-myco-93-63的发酵液中分离出蛋白质粗提物,经SDS-PAGE电泳检测,蛋白质粗提物相对分子量在15~60kD范围内。该蛋白质粗提物对8种供试植物病原菌均未表现出抑制作用。但能诱导烟草的过敏反应,处理12h后,处理部位出现水渍状,24h后出现坏死斑。室内盆栽试验表明,该蛋白质粗提物可以诱导黄瓜对白粉病的抗性,诱抗效果为54.49%。

玫瑰黄链霉菌片剂对根结线虫病的防治作用及对土壤微生物区系的影响

玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63是从马铃薯疮痂病自然衰退土壤中筛选到的对多种重要植物病原菌具有较强抑制作用的拮抗链霉菌,其发酵液对根结线虫具有较好的防治作用。为明确Men-myco-93-63活菌片剂在蔬菜根结线虫防治中的应用前景,采用温室盆栽法和稀释平板法研究了Men-myco-93-63活菌片剂对黄瓜根结线虫病的防治效果及对土壤微生物区系的影响。结果表明:Men-myco-93-63片剂对黄瓜根结线虫病具有较好的防效,1.0和1.5 g/株用量下防效分别为51.85%和55.56%,而对照药剂淡紫拟青霉颗粒剂1.5 g/株及M en-myco-93-63固体发酵物(发酵物与病土体积比为1∶200)的防效分别为54.17%和50.00%;施药60d后,该片剂对植株根际土壤中微生物区系影响较大,1.0 g/株用量下,细菌和放线菌数量分别比空白对照增加了225.45%和75.45%,真菌数量降低了66.43%,3种可培养微生物的总量比空白对照增加了195.35%,表明M en-myco-93-63片剂的施用可明显改善根际土壤中的微生物结构。

玫瑰黄链霉菌对根结线虫的防效及对土壤微生物区系的影响

利用玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63菌株的固、液体发酵物防治设施番茄和黄瓜根结线虫,研究其对根结线虫的防效以及施用生防菌对土壤微生物区系的影响。结果表明:Men-myco-93-63菌株固体发酵物1V∶200V对黄瓜和番茄根结线虫病的防效分别达到了65.62%和57.69%;施用生防菌使得植株根际土壤中细菌数量增加了19.57%,放线菌数量增加了316.67%,真菌数量降低了28.57%,以上3种可培养微生物总量由7.4×106cfu·g-1增加到16.75×106cfu·g-1,增加了126.35%。

玫瑰黄链霉菌抗药性标记及其定殖和促生作用研究

选用腐霉利、多菌灵、甲基托布津、利福平、青霉素、链霉素、泰乐菌素、重铬酸钾等8种常用抗生素或杀菌剂,通过抗药性标记试验,建立了玫瑰黄链霉菌(Stremptomyces roseoflavus)Men-myco-93-63的抗药性标记,确定了重铬酸钾(0.06g/L)/青霉素(0.2g/L)为适合检测该菌株的标记药剂及浓度。通过获得的抗药性标记,结合菌落形态观察和16SrDNA序列分析,研究了Men-myco-93-63在番茄根际土壤中的定殖动态和对植株生长的影响。结果表明,该生防菌在番茄根际土壤中能够定殖,接菌15d后定殖量达到最高,为5.6×105 cfu/g,之后下降,到30d后检测不到Men-myco-93-63菌株的存在。当使用Men-myco-93-63的固体发酵物与土壤以体积比1∶400混合时,对番茄苗期生长有促进作用。

玫瑰黄链霉菌活性代谢产物诱导烟草灰霉病抗性机制研究

【目的】解析温室条件下玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63活性代谢产物Roflamycoin和Men-myco-A(简称R&M)诱导烟草灰霉病抗性的作用机制,为利用R&M绿色防控烟草灰霉病提供理论依据。【方法】通过80 mg/L R&M注射4~5叶期本生烟草叶片后过敏反应(HR)染色验证及100 mg/L R&M注射4~5叶期本生烟草叶片后抗病标志基因hsr203J的表达验证R&M的诱抗作用;采用相关试剂盒检测烟草处理(分别为80 mg/L R&M喷雾处理和清水处理)后非药剂接触烟叶内过氧化氢酶(CAT)和脂氧合酶(LOX)的活性变化,以及防御相关物质过氧化氢(H_(2)O_(2))的含量变化。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测烟草处理(处理1,用80 mg/L R&M溶液灌根处理4~5叶期本生烟草2 d后,于上部第3片叶采用灰霉菌孢子悬浮液摩擦接种;处理2,清水灌根处理4~5叶期本生烟草2 d后,于上部第3片叶采用清水摩擦接种)后烟草叶片木质素合成基因PAL及病程相关蛋白(PR)基因PR1、PR5相对表达量的变化。【结果】80 mg/L R&M诱导处理后,烟叶中CAT活性2 d后逐步提高;LOX活性第3 d后显著提高(P<0.05,下同),第7 d达最高值;H_(2)O_(2)含量在第1 d迅速增加后降低;PAL基因相对表达量在24 h后显著上调,为清水对照的25.37倍;病程相关蛋白基因PR1、PR5相对表达量分别在24和72 h达最高值,分别为清水对照的11.23和11.17倍。【结论】R&M通过提高烟叶中相关防御酶活性、协调活性氧水平及增强抗病相关基因的表达等提高烟草植株的抗病性。玫瑰黄链霉菌Men-myco 93-63产生的活性代谢产物R&M具有作为植物病害诱抗剂的潜力,有望应用于植物灰霉病等重要病害的绿色防控。