产志贺毒素大肠杆菌O138 stx2e基因的克隆与序列分析

目的构建产志贺毒素大肠杆菌O138stx2e基因重组质粒,并比较不同型Stx之间的区别。方法根据GenBank发表的stx2e序列设计了一对特异性引物,用PCR的方法扩增从临床分离到的产志贺毒素大肠杆菌O138的stx2e基因,将其克隆到pGEM-T载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,经酶切和PCR鉴定,而后进行测序。并利用DNASIS序列分析软件对GenBank报道的O22菌株和噬菌体P27的stx2e和O138菌株的stx2e基因序列进行了比较分析,并对O138的stx2e氨基酸残基序列与stx1、stx2和O22菌株stx2e序列进行比较。结果所克隆的O138的stx2e与O22菌株和噬菌体P27的stx2e在碱基序列上同源性达到996%,O138的Stx2e与O22的Stx2e在氨基酸水平上其序列完全相同。Stx2e与stx2的同源性在85%以上,而stx2e与stx1的同源性只有42%左右。结论克隆了stx2e基因,为研究stx2e的结构和功能奠定了基础。

大肠杆菌毒素stx2eB-LTB-ST融合基因的构建与表达

利用PCR技术,从病原性大肠杆菌中扩增Stx2e及LT毒素B亚基的基因并扩增ST基因,用复式PCR技术获得了这三段基因的两种融合结构,一种是三段基因直接相连,另一种是在这三段基因之间加入适当的Linker序列。在这两种融合基因两端加入适当的酶切位点并分别与pMD18-T载体相连,酶切后以正确的阅读框插入pET28a载体的多克隆位点中,转入受体菌BL21(DE3)进行表达,得到两种约28 Ku的蛋白,表达的融合蛋白均以包涵体的方式存在,约占全菌蛋白表达量的30%,将包涵体初步提纯,为下游工作奠定了基础。

志贺氏菌样毒素Stx2e缺失突变株的构建及部分生物学特性的分析

水肿病是能由产志贺样毒素型大肠杆菌产生的Stx2e毒素引起的一种细菌传染病,对断奶仔猪有较高的致死率,常造成较大的经济。当前,Stx2e毒素影响病原菌与靶细胞之间的相互作用机制不明确,Stx2e基因缺失株作为后选疫苗的潜力有待确认。本研究中我们利用Red重组系统构建了大肠杆菌1522(serotype O139:K12:H1)和1525(serotype O157:H19)的Stx2e基因缺失株,并通过PCR检验,DNA测序手段以及Vero细胞毒性试验在细胞水平加以验证。研究发现,在同样的培养条件下,1522△Stx2e株的生长特性与原型株相比没有差异,其分解发酵糖类和氨基酸的能力也未发生改变,但是相较野生株,Stx2e基因缺失株粘附猪肠上皮细胞IPEC-J2的能力大幅度降低,可达30%。将表达K99菌毛操纵子基因克隆入1522△Stx2e中,该重组菌能够同时表达K99菌毛和自身的F18菌毛基因,且该重组株的粘附IPEC-J2细胞能力相较原型株增强近1倍。