菲立磁细胞内标记兔骨髓基质细胞的初步观察

目的:探讨利用菲立磁(Feridex)和转染试剂体外标记兔骨髓基质细胞的可行性,为临床上应用磁共振成像(MRI)追踪标记细胞奠定基础。方法:9只2月龄新西兰大白兔无菌条件下行股骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获取兔骨髓基质细胞,用菲立磁-多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)标记骨髓基质细胞,采用普鲁士蓝染色和台盼蓝拒染实验等方法鉴定FE-PLL标记兔骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并在增殖条件下用改良SABC法进行抗单克隆神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色(DAB-H2O2棕色法呈色)和普鲁士蓝(Prussian blue)染色,对FE-PLL标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。结果:菲立磁可以高效率地标记兔骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。标记的骨髓基质细胞与正常未标记细胞相比较,细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的差异。结论:菲立磁可以用来体外标记骨髓基质细胞,标记后对骨髓基质细胞活力、增殖和分化能力无明显影响。

螯合Cy5-AMT-SPIONs双模探针在急性颞叶癫痫模型中的靶向定位

目的探讨螯合Cy5-AMT-SPIONs双模探针在氯化锂-皮罗卡品诱导急性颞叶癫痫模型病灶中的靶向定位作用。方法将30只急性颞叶癫痫大鼠随机平均分为超顺氧化铁磁性纳米粒子组(SPIONs组)、Cy5标记的超顺氧化铁磁性纳米粒子组(Cy5-SPIONs组)、Cy5标记的α-甲基色氨酸的超顺氧化铁磁性纳米粒子组(Cy5-AMT-SPIONs组)。各组分别于注射药物前、注射后4 h行同参数MR T_2序列和T_2map序列并使用T_2mapping软件测量T_2值。行普鲁士蓝染色观察铁粒子在海马区的分布,在激光共聚焦显微镜下观察Cy5在大脑中的分布,行免疫荧光染色观察星形胶质细胞增生情况,行尼氏染色观察神经元缺失情况。结果 SPIONs组T_2信号稍下降,Cy5-SPIONs组T_2信号稍下降,Cy5-AMT-SPIONs组T_2信号明显下降。普鲁士蓝染色观察铁离子在海马区的分布,可见蓝棕色颗粒分布,主要分布在细胞浆内,Cy5-AMT-SPIONs组相对其他两组有明显差异。激光共聚焦显微镜下观察Cy5荧光分布各组间有明显差异。免疫荧光法各组均可见星形胶质细胞增生,各组无明显差异。尼氏染色各组均可见神经元缺失情况,各组无明显差异。结论 Cy5-AMT-SPIONs双模探针对癫痫有精确靶向定位作用且对脑组织无明显毒害作用。

超顺磁性氧化铁纳米粒子标记心脏内骨髓间充质干细胞及活体磁共振示踪的实验研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamaganetic iron oxide nanoparticles,SPIO)能否作为示踪剂在磁共振下对移植入梗死边缘区的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)进行体内追踪。方法:体外培养MSCs用SPIO标记后普鲁士蓝染色观察标记率及MTT法观察其对MSCs活性的影响。建立大鼠急性心肌梗死模型,分磁性细胞移植组、非磁性细胞移植组、纳米粒子移植组,分别于梗死心肌边缘区多点注射SPIO标记MSCs、未标记MSCs、SPIO。术后3、7、14、21d行MRI检查后处死大鼠,进行组织学检查。结果:SPIO标记MSCs阳性率达95%,对MSCs的活性和分化无明显影响。磁性细胞移植组术后3、7、14d在MRT2像显示的低信号注射点为65.6%、56.3%、18.8%,术后21d不能显示注射点。随时间的延长,低信号区域边界模糊,范围扩大,信号对比度降低。结论:SPIO可以作为示踪剂在磁共振下对移植入大鼠梗死边缘区的MSCs进行体内追踪,该方法能够作为一种无创的手段来示踪体内干细胞的迁移及转归。

菲立磁标记大鼠骨髓基质细胞及自体移植后磁共振示踪的研究

目的初步探索利用菲立磁(Feridex)和转染试剂体外磁性标记大鼠骨髓基质细胞这一方法的可行性,为将来临床上应用磁共振成像(MRI)追踪标记细胞奠定基础。方法无菌条件下行股骨取骨髓,梯度密度离心法分离获取大鼠骨髓基质细胞,使用“Feridex-多聚赖氨酸复合物(FE-PLL)”标记骨髓基质细胞,采用普鲁士蓝染色、电镜和台盼蓝排除实验等方法鉴定FE-PLL标记大鼠骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并对FE-PLL标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。将FE-PLL标记和未标记后的骨髓基质细胞分别移植入大鼠左右侧尾壳核脑内,细胞移植后1、4、7周应用MRI对脑内移植的细胞进行活体示踪,最后利用组织切片进行普鲁士蓝染色。结果菲立磁可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99%左右。普鲁士蓝染色显示FE-PLL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示FE-PLL标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。与正常未标记的细胞相比较,FE-PLL标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影像。MRI检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,未标记细胞侧脑组织无明显的低信号改变,与组织学切片结果基本相一致。结论以上结果提示菲立磁可以用来体外标记骨髓基质细胞。

PSI-g-PEG-DDA对油溶性超顺磁性氧化铁纳米粒子的包覆及对肿瘤核磁造影成像的研究

天冬氨酸(ASP)自身热缩聚产物聚琥珀酰亚胺(PSI)通过与氨基化聚乙二醇单甲醚(α-胺基-ω-甲氧基-聚乙二醇)和十二胺(DDA)进行连续两步开环反应,制备了双亲性蜈蚣形聚合物聚琥珀酰亚胺接枝聚乙二醇与十二胺(PSI-g-PEG-DDA).随着改变疏水链段DDA的接枝比例,通过胶束粒径的变化确定了最佳的接枝比例.核磁共振波谱(1H-NMR)及凝胶渗透色谱(GPC)对聚合物的性质进行了表征.通过相转移法,聚合物对油溶性超顺磁性氧化铁纳米粒子进行包覆,制备了新型的水溶性超顺磁性氧化铁纳米粒子(PSI-g-PEGDDA@IONPs).动态光散射(DLS)和透射电镜(TEM)对新型的水溶性氧化铁纳米粒子的粒径与形貌进行了表征.体外T2核磁造影成像(MRI in vitro)确定了制备的氧化铁纳米粒子的R2质子驰豫率.肝癌小鼠模型的体内核磁造影成像(MRI in vivo)结果表明新型氧化铁纳米粒子对肿瘤部位有明显的T2核磁造影增强效应,并有很长的体内循环半衰期.以上实验结果表明,新型的水溶性纳米氧化铁粒子可以作为一种潜在的用于肿瘤检测的核磁造影剂.

肿瘤双靶点RGD10-NGR9超顺磁性氧化铁的构建及其动物磁共振成像特点

目的构建肿瘤血管生成靶向的双靶点RGD10-NGR9超顺磁性氧化铁（USPIO），评价其作为活体磁共振成像（MRI）肿瘤特异性诊断制剂的能力及其成像特点。方法设计合成RGD10-NGR9双靶点杂合肽。采用共沉淀法制备网状交联葡聚糖包覆的USPIO，环氧氯丙烷活化葡聚糖，共价偶联靶向多肽，制备靶向多肽-网状交联葡聚糖-顺磁性氧化铁复合粒子（P—CLN—Dextran—USPIO），并检测其物理性质。采用普鲁士蓝染色和邻菲罗啉比色法检测P—CLN—Dextran．USPIO体外细胞结合能力。建立裸鼠荷A549瘤模型，评价双靶点RGD10-NGR9-SPIO应用于裸鼠MRI检测的价值。结果成功制备P-CLN—Dextran—USPIO，其中Fe3O4粒径8～10nm左右，Dextran—USPIO的总粒径平均为20nm左右，P—CLN—Dextran—USPIO的总粒径在30nm左右，物理性质稳定。普鲁士蓝染色显示，非靶点USPIO组HUVEC细胞质内未见蓝色铁颗粒，RGD10-USPIO组和NGR9-SPIO组HUVEC细胞质内均可见蓝色铁颗粒，RGD10-NGR9-USPIO组HUVEC细胞质内蓝色铁颗粒最明显。邻菲罗啉比色显示，非靶点USPIO组、RGD10-USPIO组、NGR9-SPIO组和RGD10-NGR9-SPIO组细胞内的铁浓度分别为（1．93±0．35）μmol／L、（4．74±0．76）μmol／L、（5．85±0．48）μmol／L和（10．32±1．22）μmol／L，RGD10-NGR9-USPIO胞内的铁浓度最高，与非靶点USPIO组、RGD10-USPIO组、NGR9-SPIO组差异有统计学意义（均P〈0．05）。裸鼠MRI显示，双靶点RGD10-NGR9-SPIO可以减弱肿瘤部位信号，显著提高肿瘤部位与周围组织之间的病灶对比度噪声比（CNR），较未注射时提高2．83倍（P〈0．05）。结论双靶点RGD10-NGR9-USPIO作为一种阴性造影剂，具有肿瘤新生血管MRI分子成像的应用价值。