奶牛X性控冻精应用研究

利用SX—MOFLO精子分离设备分离奶牛XY精子，将分离后的奶牛X精子冷冻保存。探讨奶牛X性控冻精解冻后存活时间、不同方法进行人工授精的受胎率，为奶牛X性控冻精的大规模推广应用提供依据。方法与结果：（1）取不同种公牛、不同批次的X性控冻精及普通冻精解冻后倒人5ml。试管内摇匀，至37℃水浴锅中，每2h检测一次精子活力，4h后每小时检测一次精子活力，直至无运动精子。结果奶牛X性控冻精存活时间为5～12h，比同种普通精于的存活时间短2～10h。（2）应用奶牛X性控冻精人工授精的母牛的情期受胎率（59．4％=342／576）与普通冻精的情期受胎率（60．6％=129／213）相比，无显著差异（P〉0．05）。奶牛X性控冻精母犊出生准确率93．3％（319／342），极显著地高于普通冻精48．8％（63／129）的母犊率（P〈0．001）。且应用奶牛X性控冻精人工授精后的青年牛的情期受胎率（65．6％=240／366）极显著的高于经产牛的情期受胎率（48．6％=102／210）（P〈0．001）。（3）在母牛发情结束后6～8h左右进行人工授精，其情期受胎率为67．1％（116／173），显著地高于在母牛发情开始后8～12h进行人工授精56．1％（226／403）的情期受胎率（P〈0．01）。（4）在准确判断母牛卵巢上卵泡发育状态的前提下，将精液全部输至发育侧子宫角大弯处，其情期受胎率62．7％（289／461），高于母牛每侧子宫角输1／2支X性控冻精46．1％（53／115）的情期受胎率，但二者之间差异不显著（P〈0．05）。研究结果表明应用奶牛X性控冻精进行人工授精，其受胎率与奶牛的经产与否、授精时间和输精部位有关。

不同浓度稀少精子冷冻技术效果的观察

目的:回顾性分析常规精子冷冻技术和稀少精子冷冻技术对重度少精子症患者精子冷融效果,探索稀少精子冷冻保存的有效方法。方法:收集82例重度少精子症患者精液,采用稀少精子冷冻技术冷冻标本,与24例采用常规冷冻技术冷冻的少精子症(精子浓度<15×10~6/ml)标本进行比较。前者又根据按不同浓度分为A组(精子浓度<1×10~6/ml,n=54)、和B组(1×10~6/ml≤精子浓度<5×10~6/ml,n=28),后者为C组。比较3组精子冷冻复苏率和回收率。结果:A、B、C组3组复苏率分别为(62.8±18.7)%、(61.9±17.2)%、(50.7±13.5)%,回收率分别为(68.7±18.4)%、(70.7±15.5)%、(29.2±12.4)%;以上指标,A、B组之间均无显著差异(P>0.05),但A组和B组均显著高于C组(P<0.05)。结论:稀少精子冷冻技术在临床中已趋于成熟,冻融结局相对稳定,是一种值得推广的男性生育力保存方式。

取精后至冷冻前的间隔时间对精子冷冻复苏效果的影响

目的:探讨取精后至冷冻前的间隔时间对精子冷冻复苏率的影响,规范精液标本冷冻技术操作,进一步提高冻存标本的复苏率。方法:选取2015年3月在门诊行精液分析的30例参数正常精液标本,同一例精液一式3份,分别在精液取出后15、30 min及60 min后行精液冻存,即按所有样本按孵育时间的不同分为A(15 min)、B(30 min)、C(60 min)三组,每组30例。分析三组标本冷冻前后前向运动(PR)精子数、存活率及精子畸形率,比较各组精子的冷冻复苏率。结果:A组的PR精子冷冻复苏率(55.35±13.94)%及B组的(51.55±15.94)%均高于C组的(38.13±14.24)%,比较差异均有统计学意义(P<0.05);而A组与B组PR精子冷冻复苏率比较差异无统计学意义(P>0.05),但A组略高。三组精子存活率及正常形态精子百分率比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:精子取出后应尽快完成冷冻,有助于提高精子冷冻复苏效果。

一种非Piezo依赖的高卵子存活率小鼠显微授精技术

目的对已建立的非Piezo依赖的小鼠显微授精技术作进一步改良,以获得更高的卵子存活率。方法将卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)技术中对卵子深吸持后直接深穿刺(一步法非Piezo-ICSI组)的步骤分成两步进行(两步法非Piezo-ICSI组):先浅吸持后浅穿刺,再进一步深吸持后深穿刺;另以孤雌激活发育的卵子作为卵子质量对照组。比较两步法非Piezo-ICSI组与一步法非Piezo-ICSI组卵子的存活率、原核出现率和卵裂率。结果两步法非Piezo-ICSI组的卵子存活率(92.2%)显著高于一步法非Piezo-ICSI组(83.7%)(P<0.01);而原核出现率和卵裂率与一步法非Piezo-ICSI组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论小鼠卵子胞膜在被新型持卵管深吸持时的变形造成了部分卵子胞膜变脆,两步法吸持穿刺在深吸持前进行了穿刺,避免了脆性敏感时的穿刺,有利于卵子存活。

不同剂量的甲睾酮对小鼠生精功能的影响

目的探讨不同剂量的甲睾酮对雄性小白鼠生殖系统的发育及精子发生的影响。方法将40只昆明小白鼠随机分为4组,每组10只,每天分别向各组灌喂甲睾酮16mg/kg,32mg/kg,64mg/kg和等量蒸馏水(对照组),连续灌喂7d。结果睾丸酮灌喂量为16mg/kg时,胸腺显著增大(P<0.05),而用药量达到32mg/kg时,胸腺增重受到抑制;睾丸指数随用药量的增加而增大,用甲睾酮64mg/kg时睾丸指数极显著地高于其他各组(P<0.01);精子活率用甲睾酮16mg/kg达到62.82%显著地高于对照组(P<0.05);精子畸形率随用药量的增加而提高,达到以64mg/kg时,精子畸形率最高为4.94%,显著地高于对照组和其他各组(P<0.05)。精子密度用甲睾酮64mg/kg最高为3.0×106,显著地高于对照组(P<0.01)。结论适量甲睾酮能提高精子活率,大剂量使精子活率降低,胸腺发育受到抑制。

贝类精子质量检测与评价方法研究Ⅰ:染色法检测马氏珠母贝精子的存活率的研究

用曙红Y、台盼蓝染料对马氏珠母贝(Pinctada martensii)精子进行染色,通过对不同制片方法、不同的染色时间和不同染料浓度的染色效果进行比较,筛选出可通过染色特征来检测精子死活及活精率的适宜方法,结果显示:(1)经染色后,死、活精子呈现出明显不同的特征:活精子均不着色,头部呈梨形、无色透明状;死精子着红色(曙红Y染色)或蓝色(台盼蓝染色),体积变大,头部近圆形。(2)曙红Y、台盼蓝最适染色浓度分别为0.04%和0.2%;最佳染色时间均为15min。(3)检测到的精子死亡率即实测精子死亡率,与"理论死亡率"之间有明显的相关性,相关系数为R=0.99(P<0.01),并且两种染色法的观察结果一致,表明这些检测结果客观可信;(4)染料对活精子毒性的检测显示,染色45min内,精子死亡率无显著性增加(P>0.05),说明在该时间范围内,染液对精子的毒性较小,精子存活率的检测结果稳定可靠。这些研究表明,曙红Y、台盼蓝两种染色法准确灵敏,均适宜用于马氏珠母贝精子质量的检测与评价。

同源与异源精子对方正银鲫子代存活、生长及性别的影响

5月中下旬繁殖季节,用方正银鲫(Carassius auratus gibelio)的卵子分别与麦穗鱼(Pseudorasbora parva)(方正银鲫♀×麦穗鱼♂,简称FM)、方正银鲫(方正银鲫♀×方正银鲫♂,FF)和荷包红鲤(Cyprinus carpio)(方正银鲫♀×荷包红鲤♂,FH)的精子进行人工授精,孵出的仔鱼在网箱中饲养,测定和统计各组子代的存活率、绝对增重率和性比等。结果表明:FF子代的成活率(91.15±1.78%)极显著地高于FM(87.50±2.13%)和FH(85.00±1.04%)(P<0.01),FM和FH之间差异不显著(P>0.05);FM(20.17±4.33 g)、FH(23.13±3.58 g)子代的出池体质量显著高于FF(18.90±3.82 g)(P<0.05),无论雌性还是雄性子代,组间差异均极显著(P<0.01),而组内、性别间生长差异不显著(P>0.05);FM(99%)、FF(73%)和FH(99%)子代的雌性百分比明显偏向雌性(P<0.01),且组间差异极显著,异源精子受精后子代中雌鱼比例明显增高(P<0.01)。本研究结果证明:银鲫生长性状中存在"异精效应",异源精子对子代的存活率和性别比例有显著影响,对生产中积极利用异源精子提供了数据支持。

不同咖啡因浓度对鸡精液冷冻效果的影响

以广东海洋大学家禽育种中心的小麻大冠鸡为试验材料,利用液氮制作颗粒冷冻精液,研究不同浓度咖啡因对鸡精液解冻后的精子活力、畸形率和存活时间的影响。结果表明:咖啡因添加量为4mmol/L时,鸡精液冷冻解冻效果最佳,精子活力最高,为0.46,畸形率最低,为7.2%,精子体外存活时间最长,为105min。

稀释液溶质和渗透压对鸡精子体外存活及形态的影响

将三种糖（葡萄糖、蔗糖、果糖）、三种有机盐（柠檬酸钠、柠檬酸钾、谷氨酸钠）、两种无机盐（氯化钠、氯化钾）共８种物质，分别配成 ７个渗透压水平（１００～ ７００ ｍｏｌ／Ｌ）共计 ５６种精液稀释液，在 ３－ ５℃下进行鸡精液保存试验。结果表明：精子最高生存指数出现在三种有机盐的稀释液中；两种无机盐液中精子存活时间最长，但畸形率很高；蔗糖和谷氨酸钠液的精子畸形率只有５．２９％和５．４０％。在３３ ｍｏｌ／Ｌ时精子生存指数、存活时间均较好；５００ ｍｏｌ／Ｌ时精子畸形率最低；渗透压值与精子头部畸形类型高度相关（Ｐ <０．０１），与精子头部弯曲且膨胀百分数的相关系数为－０．９３，与精子头部单纯弯曲的百分数的相关系数为０．９４。

小鼠卵胞浆内单精子显微注射改良技术在辅助生殖技术应用中的价值

目的研究鼠卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)改良技术在人类辅助生殖技术应用中的价值。方法将小鼠分为两组:采用固定人卵子的固定针组(C-ICSI组)和改良的喇叭型固定针组(N-ICSI组),观察两组ICSI操作后卵子存活数、卵裂情况。结果 N-ICSI组卵子存活率为77.4%,明显高于C-ICSI组的7.8%,差异有高度统计学意义(χ2=483.183,P<0.01);两组正常受精率及异常受精率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。N-ICSI组卵裂数为97.3%,明显高于C-ICSI组的80.0%,差异有高度统计学意义(χ2=18.399,P<0.01),桑葚胚、囊胚和孵化的胚胎比例差异无统计学意义(P>0.05)。结论改良的小鼠ICSI技术,可以明显提高操作时卵子的存活率,这将为人类实验室ICSI技术的质量控制和研究提供保障,同时,该项研究成果可以分析人精子激活卵母细胞的能力和人精子的核型,因此有重要的研究价值。

龙胆紫染色用于分析精子存活率的方法学研究

目的:探讨龙胆紫染色区分存活精子和死亡精子可能性,以提供一种判定精子存活率的新方法,为男性精液检测和质量评价提供依据。方法:采用不同浓度的龙胆紫溶液对精液样本染色,在光学显微镜下观察染色结果,讨论区分存活精子和死亡精子的标准,并计数一定数量的总精子数,计算存活率,并将计算结果与标准方法比较。结果:经过龙胆紫溶液(0.05%,M/V)染色后在显微镜下存活精子呈现淡蓝色,而死亡精子呈现深紫色,计算获得的存活率与伊红染色法(0.5%,M/V)的结果比较差异统计学意义(t=0.862,双侧P=0.403)。结论:一定浓度的龙胆紫染色后能够清楚地区分存活精子和死亡精子,该法获得的精子存活率结果可靠,龙胆紫染色法可以作为一种新的分析精子存活率的方法。

不同抗冻剂及初冻和解冻温度对鸡精液冷冻保存的影响

【目的】研究对不同抗冻剂及初冻和解冻温度在鸡精液冷冻保存中的效果.【方法】以‘海兰褐’种公鸡为试验材料,利用液氮制作颗粒冷冻精液,研究不同抗冻剂及初冻和解冻温度对鸡精液冻后活率、复苏率及存活时间的影响,并筛选出最佳的抗冻剂种类、浓度和初冻、解冻温度组合.【结果】3种抗冻剂组合的冷冻效果优于单一及两种抗冻剂组合,且GL 8%+DMA 6%+EG 6%组合的冻后活率、精子复苏率最高,分别为0.46和57.50%,为最佳抗冻剂组合;在此基础上,筛选出最佳初冻和解冻温度组合为-140℃和50℃,其冻后活率和复苏率最高,分别达到0.57和71.40%,并在15～25℃条件下精子存活时间为160min;在鸡精液冷冻保存中快速冷冻要对应快速解冻,慢速冷冻要对应慢速解冻,且前者精液冷冻保存效果较好.【结论】筛选出了最佳的抗冻剂组合及初冻和解冻温度,发现快速冷冻和解冻的鸡精液保存效果较好.

生精种玉汤治疗少精弱精性不育的疗效及对精液中Caspase 3和Caspase 8的影响

目的:探讨生精种玉汤治疗少精弱精性不育的疗效及对精液中Caspase 3和Caspase 8的影响,为其临床诊治提供参考。方法:选取2015年6月至2018年6月惠州市中心人民医院收治的少精弱精性不育患者96例作为研究对象,按照随机数字表法分为对照组和观察组,每组48例。对照组患者给予五子衍宗丸治疗,观察组患者给予生精种玉汤治疗,比较2组患者治疗前后精液各参数以及精液中、精子中Caspase 3和Caspase 8水平变化。结果:与治疗前比较,2组患者精子密度、精子成活率、a级精子活力以及a+b级精子活力等精液各参数均明显升高,精液中Caspase 3、Caspase 8水平和精子中Caspase 3和Caspase 8水平明显降低(均P<0.05),且观察组上述指标改善更为显著(P<0.05)。观察组患者治疗有效率为95. 83%,明显高于对照组的83. 33%,2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:生精种玉汤治疗少精弱精性不育患者,可以明显降低精液中Caspase 3和Caspase 8水平,增强精子活力,标本兼治,效果更加显著,值得临床推广使用。

精液不液化对精子总活力、存活率、精子总数及pH值的影响分析

目的探讨精液不液化对精子总活力、存活率、精子总数及p H值的影响。方法按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》,采用计算机辅助精子分析系统(computer-aided sperm analysis,CASA),对2014年1月-2014年9月到我院不孕症门诊就诊的601例不育男性精液进行检查分析,了解精液不液化对各项指标的影响。结果精液不液化组与完全液化组比较,精子总活力、存活率有显著性差异(P<0.05);而精子总数,p H值无差异,不具统计学意义(P>0.05)。结论精液不液化可降低精子总活力和存活率,成为男性不育的一个重要因素,在临床诊疗中应加强重视。

不同离心速率对波尔山羊精液低温保存效果的影响

本试验研究了离心速率对波尔山羊精子的活率、顶体完整率、存活时间、生存指数的影响 ,以期为波尔山羊的推广、利用提供科学依据和有效方法。对波尔山羊精液进行 10 0 0、2 0 0 0、30 0 0、4 0 0 0rpm离心处理 ,用含葡萄糖、柠檬酸钠、EDTA和卵黄的稀释液代替精清 ,在 4℃下保存 ,每隔 12h检测一次精子活率和精子顶体完整率。结果表明 :在这四种离心处理中以 10 0 0rpm处理效果最好 ,生存指数和保存 4 8h后的精子活率显著优于其它离心处理 (P <0 .0 1) ,精子顶体完整率显著高于其它三种离心处理 (P <0 .0 1) ,精子的存活时间达到 90h ,精子顶体完整率、精子活率和生存指数随着离心转数的增加而下降。离心冲洗处理为精子的冻前保存提供了新的试验方法 ,为进一步深入研究精清和稀释液在精液中的作用提供了新的思路。

催乳素在男性不育症199例检测中的意义

目的:探讨男性不育症与催乳素的关系。方法:采用化学发光法测定男性不育症患者血清中生殖激素催乳素水平,并比较不同病因患者的催乳素水平与FSH、LH、T的关系差异。结果:非梗阻性无精子患者FSH、LH、催乳素分别为26.22±9.35 mIU/mL、21.33±9.3 mIU/mL、25.34±13.31 ng/mL;死精子、弱寡精、弱精症的PRL测定值分别为23.61±9.49ng/mL、14.63±7.37ng/mL、17.28±4.32ng/mL,与正常值比较,差异有统计学意义。结论:催乳素与密度、成活率有密切关系,并随着催乳素升高而降低。但催乳素升高,并不能确定是影响精子密度,还是影响成活率。

甲睾酮对小鼠生殖系统发育及生精功能的影响

目的探讨甲睾酮对雄性小鼠精子的产生及生殖器官的影响。方法将48只昆明小白鼠随机分为4组，每组12只，每天分别向各组灌胃甲睾酮16mg／ks，32mg／kg，64mg／kg和等量蒸馏水（对照组），连续10d。结果与对照组比较，甲睾酮16mg／kg组精子活率最高为66．22％（P〈0．05）；甲睾酮64mg／kg组睾丸指数、精子畸形率、精子密度都极显著和显著地升高（P〈0．01和P（0．05），且睾丸组织有较明显的病理学损伤。结论适量甲睾酮能提高精子活率，大剂量使精子活率降低且畸形率升高。

40例完全不活动精子症精液参数及妊娠结局分析

目的：分析完全不活动精子症患者精液参数与妊娠结局的关系。方法：选用2015年1月～2016年6月来我院就诊的40例完全不活动精子症患者作为实验组和100例精液常规参数正常者作为对照组。按照WHO第五版伏类精液检查与处理实验室手毋崂标准，采用计算机辅助精液分析系统进行精液常规检测，分析参数包括精液量、精子浓度、PH值，采用伊红一苯胺黑染色法计数精子存活率及人工镜检观察精子形态，同时统计其妊娠结局。结果：实验组与对照组相比，精子浓度有显著性差异（P〈0．01）。PH值有统计学差异（P〈0．05），精液量无统计学差异（P〉0．05）。其中40例完全不活动精子症患者伊红染色结果在1％-92％之间，未见完全死亡精子病例。精子形态学中发生断尾者占32．5％。实验组单精子卵胞浆内显微注射（intracyto—plasmic sperm injection，ICSI）妊娠率为77．‰。结论：不活动精子症患者常多伴有精子浓度减低、PH值下降及断尾的发生。但通过精子伊红染色观察，其真实存活率较高。大多可以通过ICSI技术进助孕，且妊娠结局与精予存活率没有明显相关性。

四省一个直辖市精液分析外部质量控制网络建立的初步研究

目的在全国四省一市,建立精液分析外部质量控制网络。方法2017年在辽宁省沈阳市、甘肃省兰州市、四川省成都市、吉林省长春市和北京市,开展精液分析外部质量控制网络建立方法的初步探索。主要参加实验室为各省市三甲医院的男科实验室、生殖中心实验室、精子库实验室和临床检验实验室,共106家单位。采用在指定实验室集中发放质控品,现场评估的形式。主要外部质量控制的方法采用《WHO人类精液检查和处理实验室手册(第5版)》精液分析标准化方法,包括改良Neubauer血细胞计数板评估精子浓度、活动力视频录像评估、精子活动力、伊红苯胺黑评估精子存活率、巴氏染色方法评估精子形态,分别用变异系数(CV)和Youden图评估外部质控的结果。结果精子存活率评估四省一市两个质控品的CV均在15%以下;而仅吉林省精子浓度和辽宁省精子活动力评估中两个质控品的CV在15%以下;精子形态学评估四省一市两个质控品的CV均在15%以上。Youden图分析精子浓度显示:23.53%、25.00%、36.84%、10.00%和18.18%的质控结果均在95%可信区间(95%CI)内;Youden图分析活动力显示:9.38%、25.00%、44.44%、12.50%和30.00%的质控结果均在95%CI内;Youden图分析精子存活率显示:8.33%、37.50%、47.37%、10.00%和20.00%的质控结果均在95%CI内。结论本研究证实外部质量控制网络的建立方法可行且结果可靠,其中精子存活率最容易质控,易于操作;精子浓度和活动力的外部质控方法还需进一步优化;而精子形态评估最难质控,使用桥连显微镜的方法便于质控。

中间球海胆精子超低温冷冻保存方法的研究

对中间球海胆Strongylocentrotus intermedius精子的超低温保存技术进行了研究。以煮沸消毒海水为基础液,添加体积分数为10%的DMSO、体积分数为6%的甘油以及25 mmol/L海藻糖配制成冷冻保护液,与鲜精液按体积比以1∶1混合,在4℃下平衡15 min,于液氮面上方15、3 cm处分别停留3 min和5 min,然后浸入液氮保存。结果表明:用此方法保存的精子解冻后其存活率可达58.2%,受精率达24.7%;解冻后精子受精时,在受精海水中分别添加0、28、56、112、280 mmol/L的葡萄糖,56 mmol/L组的受精率高于其他组,受精率达26%;精子解冻后受精时,在受精海水中添加适量葡萄糖有助于提高受精率。本试验表明,冷冻过程中降温方式、冷冻保护液、平衡时间对精子的冷冻保存效果均有较大影响,各个因素通过优化组合可以大大提高解冻后精子的存活率和受精率。