甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-RPA-LFD检测方法的建立与应用

【目的】利用逆转录酶重组酶聚合酶扩增(reverse transcriptase recombinase polymerase amplification,RT-RPA)结合侧向流层析(lateral flow dipstick,LFD)试纸条技术,建立甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(west African strain,WA)的RT-RPA-LFD检测方法。【方法】根据SPCSV-WA外壳蛋白基因和热激蛋白基因的保守序列设计并筛选扩增效果好、特异性强的引物和探针。然后对引物和探针的浓度、扩增体系、温度、反应时间等条件进行优化,建立SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法。利用该方法对SPCSV-EA、甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)、甘薯G病毒(sweet potato virus G,SPVG)等常见的甘薯病毒进行检测,验证方法的特异性;将感染SPCSV-WA甘薯叶片样品总RNA进行10倍梯度稀释,分别采用RT-PCR和RT-RPA-LFD进行检测,比较RT-PCR和RT-RPA-LFD方法的灵敏度;对采自田间的甘薯样品和试管苗样品进行RT-RPA、RT-RPA-LFD和RT-PCR检测,验证该方法的实用性。【结果】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,最适引物为CSV357F/R,探针CSV-CP-Probe(47 bp),引物和探针工作浓度分别为0.2和0.06μmol·L^(-1),温度为42℃,时间5 min。该方法可对SPCSV-WA进行特异性检测,与甘薯上其他常见病毒无交叉反应。RT-RPA-LFD最低可检测到总RNA稀释至10^(-4)溶液,而RT-PCR最低检测到总RNA稀释至10^(-3)溶液,RT-RPA-LFD灵敏度是RT-PCR的10倍。田间采集的22份甘薯样品经RT-PCR、RT-RPA和RT-RPA-LFD检测,均检出11份阳性样品,3种方法检测结果一致。28份试管苗样品的检测结果表明,RT-PCR和RT-RPA-LFD检测结果一致,均检出5份阳性样品。【结论】建立了SPCSV-WA的RT-RPA-LFD检测方法,该方法具有快速、简便、特异、灵敏、可视的特点,既可用于甘薯脱毒试管苗样品的病毒检测,也适用于基层单位田间甘薯病毒样品的现场快速检测。

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒检测方法的建立

为了建立甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯矮化褪绿病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法,提高检测灵敏度,实现结果的可视化。根据SPFMV外壳蛋白基因(CP)的核苷酸序列和SPCSV的热休克蛋白基因(Hsp 70)的核苷酸序列设计4条RT-LAMP特异性引物,采取单因素优化试验,对RT-LAMP反应体系中的多个因素包括时间、温度、BST聚合酶、Mg^(2+)、RNase抑制剂、dNTPs和Betaine浓度优化,恒温扩增60 min。经琼脂糖凝胶电泳分析,SYBR Green I可视化显色,结果表明:SPFMV的优化反应体系为:FIP/BIP 2μL、F3/B30.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO 41.5μL、RNase抑制剂1.0μL、Betaine 7μL,62℃60 min。SPCSV的优化反应体系为:FIP/BIP 2μL、F3/B30.5μL、BST聚合酶1.0μL、dNTPs 0.6μL、MgSO 41.5μL、RNase抑制剂1.2μL、Betaine 7μL,64℃60 min。进一步利用SPFMV全基因组的4个片段(SPFMV-1、SPFMV-2、SPFMV-3、SPFMV-4)、SPCSV-Hsp 70和RGNNV进行特异性检验,分别建立了SPFMV和SPCSV的特异性RT-LAMP检测方法,扩增出了具有RT-LAMP的典型瀑布状条带,与凝胶电泳和SYBR Green I显色结果一致,SPFMV和SPCSV的灵敏度检测下限分别为:1×10^(-6)、1×10^(-3)ng·μL^(-1),该方法检测灵敏度高,实现了结果的可视化。对田间甘薯苗和离体组织培养甘薯苗进行检测验证,SPFMV-RT-LAMP检测方法成功率为100%,SPCSV-RT-LAMP检测方法的成功率为95%,表明研发的SPFMV和SPCSV的RT-LAMP检测方法适用于SPFMV和SPCSV的快速检测。

甘薯褪绿矮化病毒西非株系RT-LAMP检测方法的建立

【目的】基于逆转录环介导等温扩增技术(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)建立甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(West African,WA)的可视化检测方法。【方法】针对SPCSV西非株系(SPCSV-WA)的CP核苷酸序列设计4条引物,以感染SPCSV-WA甘薯叶片总RNA为模板,进行一步法RT-LAMP,在65℃条件下反应1 h。扩增产物利用琼脂糖电泳分析和SYBR green I荧光染料显色判断结果,同时对扩增产物的电泳条带进行基因克隆和测序鉴定。利用常规RT-PCR和建立的RT-LAMP方法对14份甘薯样品进行SPCSV-WA检测,比较2种方法的检测结果。【结果】建立的LAMP方法可特异地对SPCSV-WA进行检测,且最低可检测出101拷贝/μL的模板。RT-LAMP产物的克隆测序表明,感染SPCSV-WA甘薯样品的RT-LAMP产物为SPCSV-WA CP基因序列。14份田间甘薯样品检测表明,RT-LAMP与RT-PCR方法检测结果完全一致。【结论】建立的SPCSV-WA RT-LAMP可视化检测方法,是简便、可靠的SPCSV-WA检测方法。

甘薯病毒病害(SPVD)的多重RT-PCR检测方法及其应用

根据甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)热激蛋白(Hsp70)基因和甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对引物,以单一RT-PCR反应体系为基础,分别对影响多重RT-PCR扩增的退火温度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、引物浓度等条件进行了优化,建立了能同时检测SPVD两种病原的多重RT-PCR方法。该方法能有效区分SPFMV的主要株系类型。灵敏性试验表明,建立的多重RT-PCR方法对SPFMV-CH2、SPFMV-CH和SPCSV的最低检测浓度分别为1.42×104、1.32×104拷贝/μL和2.47×104拷贝/μL。该方法可用于甘薯叶片和薯块中病毒的检测,为SPVD的监测预警提供了一个有用的工具。

侵染甘薯的SPCSV、SPVG、SPFMV多重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立可同时检测甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）、甘薯G病毒（SPVG）和甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）多重RT-PCR检测方法,本文根据SPCSV热激蛋白基因（hsp70）及SPVG、SPFMV外壳蛋白基因（CP）基因核苷酸序列的保守区域设计特异性引物,通过引物筛选,优化多重RT-PCR反应条件,建立了能同时检测SPCSV、SPVG和SPFMV 3种病毒的多重RT-PCR检测方法。该体系能有效扩增出大小为304、433、601 bp 3个特异性片段。测序结果表明3种病毒与参考序列的一致性达94%-99%。应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏地同时检测单一或复合侵染3种甘薯病毒,为甘薯脱毒和病毒病诊断奠定基础。

甘薯羽状斑驳病毒和甘薯褪绿矮化病毒复合侵染甘薯引起的细胞病理学研究

2011～2012年在浙江杭州连续发现感病甘薯植株具有甘薯病毒病SPVD的典型症状,透射电镜观察发现其叶片包含有长度为600～900 nm,直径为12 nm的线状病毒粒子。使用特异性引物进行RT-PCR扩增及测序,其病原为甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)复合侵染。运用透射电镜研究SPVD引起的细胞病理学变化,观察到叶肉细胞的细胞质中含有马铃薯Y病毒属特征性柱状内含体,其结构分类为Ⅳ型;线状病毒样粒子以束状平行排列成聚集体的方式存在于细胞质中;叶绿体伸出伪足状结构包裹线粒体。在维管束细胞的筛管和伴胞中观察到弯曲线状病毒样粒子形成的聚集体,其粒子排列交错,与叶肉细胞中平行排列的病毒样粒子聚集体不同,符合毛形病毒属特征。另外还在维管束和叶肉细胞结合的部位发现复合侵染的细胞病理学特征。本研究表明危害甘薯生产的SPVD已扩散蔓延到浙江省。

甘薯褪绿矮化病毒外壳蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

克隆甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)外壳蛋白(CP)基因,构建其原核表达载体,并在大肠杆菌中进行诱导表达。根据已报道的甘薯褪绿矮化病毒西非(WA)株系基因组核苷酸序列设计引物,利用RT-PCR方法克隆了SPCSV四川分离物基因组RNA2上1 902bp大小的片段。序列分析表明,该片段包括部分p60基因序列、完整的p8基因和CP基因(major CP)序列及部分mCP基因(minor CP)序列。CP基因由774个核苷酸组成,编码257个氨基酸残基,与已发表的SPCSV WA株系Can181-9分离物相比,其核苷酸和氨基酸序列一致性分别为99.48%和99.22%。将CP基因克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,CP基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为38kD,为SPCSV抗血清的制备及其血清学检测技术的建立奠定了基础。

烟粉虱中甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)的快速检测技术

建立了利用NCM-ELISA、RT-PCR和半巢式RT-PCR检测烟粉虱中SPCSV的方法,比较了3种检测方法的灵敏性。结果表明,NCM-ELISA最低能从16头带毒烟粉虱中检测出SPCSV;RT-PCR能稳定地从3头以上带毒烟粉虱中检测出SPCSV;半巢式RT-PCR能稳定地从单头烟粉虱中检测出SPCSV。检测灵敏性研究表明,用体外转录的RNA作为核酸模板,RT-PCR可检测的最低浓度为5.69×104拷贝/μL,半巢式RT-PCR为5.69×101拷贝/μL,说明半巢式RT-PCR检测方法的灵敏性比RT-PCR高1 000倍。

甘薯褪绿矮化病毒RNase3蛋白的原核表达及抗血清制备

以本实验室保存的重组质粒为模板,利用PCR方法扩增获得了甘薯褪绿矮化病毒SPCSV的RNase3基因,RNase3基因由690个核苷酸组成,编码229个氨基酸。将RNase3基因克隆到原核表达载体pET-28a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,对诱导产物进行SDS-PAGE分析。结果表明,RNase3在大肠杆菌中能高效表达,融合蛋白分子量约为26.5kD。以表达的融合蛋白为抗原,免疫家兔,制备了SPCSV-RNase3的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清对RNase3融合蛋白的效价达10万倍。

甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)荧光定量RT-PCR检测方法的建立

【目的】甘薯病毒病(sweet potato virus disease,SPVD)是甘薯上的毁灭性病害之一,严重时可造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒(Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)2种病毒的复合侵染情况进行研究,建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】选取重庆地区具有不同SPVD典型症状的甘薯品种(系)叶片作为试验材料,对其进行症状和SPFMV、SPCSV的硝酸纤维素膜酶联免疫吸附(NCM-ELISA)检测;对供试材料叶片中的SPFMV外壳蛋白CP和SPCSV热激蛋白HSP70核苷酸序列进行克隆和序列分析,根据保守核苷酸序列设计荧光定量RT-PCR检测引物。以甘薯泛素(ubiquitin,UBI)和组蛋白(histone,H2B)编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测,与感染SPVD典型症状和NCM-ELISA检测结果进行比较,并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片检测结果进行比较,筛选可快速、精确、定量检测SPVD的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不同甘薯品种(系)的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点,同一品种(系)的不同感病植株感病症状相似但也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA),SPCSV至少存在1个株系类型(WA)。在15份供试材料中,10份材料由NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染,且荧光定量RT-PCR检测结果与发病症状和NCM-ELISA检测结果相吻合,其检测结果可准确反映甘薯SPVD染病植株中2种病毒复合侵染情况。荧光定量RT-PCR检测结果还表明,不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平存在差异;相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV中CP转录水平均相对较高,是SPCSV的HSP70转录水平的3—556倍。4份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染,而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70转录水平,说明这2份材料中也存在SPFMV和SPCSV的共同感染,表明荧光定量RT-PCR比NCM-ELISA检测结果更灵敏、准确。【结论】筛选出可利用SPFMV CP与SPCSV HSP70转录水平进行检测的荧光定量RT-PCR检测引物,建立了SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法,为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD防御体系时,需综合考虑2种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异,采取针对性的监测和预警机制。

甘薯病毒病发生关键因素研究

【目的】明确甘薯种薯携带的病毒种类与苗期病毒病发生率和严重度之间的关系,以及甘薯田烟粉虱发生量和带毒率与种薯带毒率之间的关系,建立甘薯苗期病毒病预测预报方法和种薯质量早期预警技术,为甘薯无病毒种薯生产和病毒病防控提供理论依据。【方法】利用PCR和RT-PCR方法对随机采集的不同来源的甘薯种薯进行病毒检测,检测的病毒种类包括马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)、甘薯病毒C(sweet potato virus C,SPVC)、甘薯病毒G(sweet potato virus G,SPVG)、甘薯潜隐病毒(sweet potato latent virus,SPLV)和甘薯病毒2(sweet potato virus 2,SPV2),毛形病毒属(Crinivirus)的甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)和黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)的黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV)以及甘薯双生病毒(sweepoviruses)等我国甘薯上常见的8类主要病毒。然后对检测的种薯进行育苗,出苗后调查薯苗的发病情况,分析种薯携带的病毒种类与苗期病害严重度之间的关系。2018年和2019年分别在河南、宁夏和陕西等地设置试验点,种植背景相同的甘薯品种商薯19原原种苗和脱毒试管苗,在甘薯生长期,采用黄板诱虫法调查各试验点烟粉虱发生量并采集烟粉虱活体,检测烟粉虱SPCSV带毒率。种薯收获后,随机取样对种薯SPCSV带毒率进行检测,分析甘薯田烟粉虱发生量和带毒率对种薯带毒的影响。【结果】在检测的665块甘薯种薯中,有463块种薯携带病毒,育苗后有333块种薯的薯苗表现出叶片黄化、明脉、皱缩和植株矮化等病毒病症状。当种薯携带一种或多种马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗病毒病症状主要为0—1级(其中,0级占60.6%;1级占31.8%);当种薯携带甘薯双生病毒或甘薯双生病毒与马铃薯Y病毒属病毒的组合时,薯苗病毒病症状主要为0—1级(其中,0级占55.3%;1级占32.9%);当种薯携带SPCSV时,苗期病毒病症状显著加重,特别是当种薯同时携带SPCSV与马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗显症率为100.0%,症状主要为3—9级(其中,3级和5级占49.0%、7级和9级占51.0%)。连续2年田间试验结果表明,甘薯田烟粉虱发生量和带毒率与种薯带毒率密切相关,回归方程为Y=9.628X1+0.008X2+6.537,R2=0.914,其中,Y为种薯SPCSV的带毒率,X1为烟粉虱带毒率,X2为烟粉虱发生量。【结论】种薯携带SPCSV是苗期病毒病严重发生的关键因素,当种薯同时携带SPCSV与马铃薯Y病毒属病毒时,薯苗病毒病显症率和严重度显著增加。甘薯田烟粉虱发生量和SPCSV带毒率与种薯带毒率密切相关,烟粉虱是影响种薯携带SPCSV的关键因素。

甘薯病毒病害(SPVD)的分子生物学研究进展

甘薯病毒病害(SPVD)是最主要的甘薯病毒病害之一,研究表明甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)和甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)共同侵染形成SPVD。本文综述了SPFMV和SPCSV这2种病毒的生物学特性、检测方法、基因组结构与遗传变异等方面的研究进展,为阐明多种病毒混合侵染机制和防控措施提供了一定的理论依据。

3种甘薯病毒多重PCR检测方法的建立与应用

针对甘薯卷叶病毒(SPLCV)、甘薯羽状斑驳病毒(SPFMV)、甘薯褪绿矮化病毒(SPCSV)的外壳蛋白(CP)基因序列,设计了3种病毒的3对特异性引物,扩增大小分别为180、295、774 bp,通过对引物添加量、退火温度、循环数等反应条件的优化,完善了能同时扩增出SPLCV、SPFMV、SPCSV 3种病毒的多重PCR体系,可以实现同时对甘薯3种病毒104拷贝水平的检测,并具有良好的特异性。利用该技术体系,对不同田间样品进行了检测,PCR产物测序表明,3种病毒序列与已知的参考序列同源率一致性分别达到94%、94%、97%及以上。建立能够同时进行3种病毒检测的多重PCR检测技术体系,可以快速准确地进行甘薯脱毒苗病毒检测和田间样品的诊断。

甘薯羽状斑驳病毒和褪绿矮化病毒重组双CP融合基因的原核表达和抗血清的制备

由褪绿矮化病毒(SPCSV)和羽状斑驳病毒(SPFMV)协生共侵染引起病毒病(SPVD)是甘薯最严重的病害之一。为了建立一种高效的甘薯病毒病SPVD检测体系,本研究构建了SPCSV和SPFMV重组双CP基因的原核表达载体pET22b-SPVD-CP,该重组菌在20℃条件下经IPTG诱导,获得了68 kDa的融合蛋白(重组双CP)。利用高纯度重组双CP为抗原免疫家兔,获得了SPVD的抗血清,间接ELISA检测显示抗体稀释度在1∶512 K的范围内,制备的抗体与抗原具有较强的结合活性。本研究结果为利用重组CP作抗原大量制备SPVD抗体奠定了基础。

烟粉虱对甘薯种薯带毒率及病毒病发生的影响

病毒病是影响甘薯产量和品质的重要限制因素。甘薯褪绿矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)和甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)是危害我国甘薯的主要病毒。甘薯种薯感染SPCSV是甘薯苗期病毒病严重发生的关键因素。本研究分析了甘薯田烟粉虱发生量和带毒率对种薯带毒率及病毒病发生的影响,建立了甘薯种薯感染病毒风险和苗期病毒病发生风险的早期预警方法。结果表明,甘薯田烟粉虱发生量和SPCSV带毒率与种薯SPCSV带毒率密切相关,在田间烟粉虱发生量和带毒率较高的情况下,即使种植不含任何病毒的脱毒试管苗,也会引起较高的种薯带毒率,但不会引起甘薯地上部植株的严重显症。甘薯种薯SPCSV带毒率以及SPCSV和SPFMV复合带毒率与苗期病毒病显症率呈极显著正相关关系,可以利用种薯带毒率预测甘薯苗期病毒病显症率。

我国发现由甘薯褪绿矮化病毒和甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染引起的甘薯病毒病害

甘薯病毒病害（Sweet potato virus disease,SPVD）是由毛形病毒属（Crinivirus）的甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）和马铃薯Y病毒属（Potyvirus）的甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）协生共侵染甘薯引起的病毒病害[1]。

甘薯褪绿矮化病毒西非株系实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

依据Gen Bank中登录的甘薯褪绿矮化病毒(Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV)西非株系(WA)的核苷酸序列,分别设计两对特异性引物和一条Taq Man探针。以SPCSV-WA外壳蛋白(cp)基因的重组质粒为阳性标准质粒绘制标准曲线,通过优化反应体系和反应条件,建立了SPCSV-WA的实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法只能检测到目的病毒,标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.239和1,扩增效率为103.568%。最低可检测到约3.31 copies/μL的阳性质粒,灵敏度比常规PCR高1 000倍。本研究建立的SPCSV实时荧光定量PCR方法可用于田间样品的检测,为SPCSV的早期预警和流行学研究提供了技术手段。