标准曲线法与自动阈值法对TREC检测结果稳定性的影响

为评价实时荧光PCR法检测T细胞受体剪切环(TREC)时,标准曲线法或自动阈值法对不同操作批次重复检测结果稳定性的影响,采用同一批次TREC检测试剂盒重复检测标准质粒中内参基因与靶标TREC的Ct值,同时重复检测一组TREC低值样本的Ct值;分别采用标准曲线法和自动阈值法对检测结果进行分析,比较两种分析方法得到结果(Ct值)的稳定性。对标准质粒和TREC低值样本的检测结果表明,两种分析方法得到的Ct值与两个靶标的标称浓度(log10)均呈线性相关,R^(2)为1.00。两种方法获得标准质粒中内参基因Ct平均值,标准曲线法较自动阈值法平均低1.26,标准质粒中TREC基因Ct平均值,前者较后者平均低0.96。对TREC低值样本重复检测结果表明,同一样本标准曲线法获得的两种靶标Ct值的变异系数(CV)和极差均低于自动阈值法。表明在以实时荧光PCR法检测TREC靶标从而进行重症联合免疫缺陷(SCID)的筛查时,标准曲线法的分析结果稳定性优于自动阈值法。

实时定量PCR检测正常人外周血T细胞和胸腺细胞中sjTRECs水平

目的 了解正常人外周血T细胞和胸腺细胞中信号结合T细胞受体删除DNA环 (sjTRECs)的含量 ,从而推测正常人中幼稚T细胞的含量和胸腺的输出功能 .方法 利用实时定量PCR和TaqMan方法检测 11例正常人外周血单个核细胞、7例儿童和 3例成人胸腺细胞DNA中sjTRECs的水平 .结果 正常人中sjTRECs含量分别为 :8.83±4.81/ 10 0 0个外周血单个核细胞 ;2 7.31± 3.2 3/ 10 0 0个成人胸腺细胞和 170 .2 9± 5 9.5 2 / 10 0 0个儿童胸腺细胞 .结论 sjTRECs水平与年龄有关 ,正常人外周血中每 10 0 0个单个核细胞中约含 4.

TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs在正常人胸腺、脐血和外周血中的检测情况

目的建立检测TCR Vβ2、Vβ5和Vβ17-Dβ1 sjTRECs的方法,分析其在胸腺细胞、脐血和正常人外周血T细胞中的存在情况,从而了解近期胸腺输出相应的TCR Vβ亚家族naive T细胞的情况。方法利用半巢式PCR分别扩增3例正常胸腺细胞1、0例脐血和10例正常人外周血单个核细胞DNA中的Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ1基因片段重排时产生的sjTRECs。结果在正常胸腺细胞、脐血和正常人外周血单个核细胞中均可检测到Vβ2、Vβ5和Vβ17与Dβ1片段形成的sjTRECs,其中胸腺细胞和脐血单个核细胞DNA中3种删除环的检出率均为100%,正常人外周血3种删除环的检出率分别为50%、70%和40%。结论成功地建立检测3种V-βDβ1 sjTRECs的方法,并提供了Vβ2、Vβ5和Vβ17亚家族sjTRECs在胸腺、脐血和外周血中的检测情况。

重度苯中毒患者T细胞受体Vβ亚家族TRECs的分析

目的检测重度苯中毒患者外周血23个TCRVβ-Dβ1TRECs的存在情况,进一步了解重度苯中毒患者胸腺近期各Vβ亚家族初始T细胞的输出情况。方法分别在5×104和1×104个外周血单个核细胞水平下,采用半巢式对12例重度苯中毒患者和10例正常人的23个TCRVβ-Dβ1TRECs进行扩增。结果在5×104和1×104细胞水平下,苯中毒组检出各TCRVβ-Dβ1TRECs数均显著低于对照组(P<0.05)。在5×104细胞水平时,对照组检测到23个TCRVβ-Dβ1TRECs,苯中毒组仅检测到17个TCRVβ-Dβ1TRECs,其中12个TCRVβ-Dβ1TRECs检出率与对照组相比明显降低(P<0.05)。结论本研究提供了苯中毒患者外周血中各TCRVβ-Dβ1TRECs存在情况。苯中毒患者TCRVβ-Dβ1TRECs检出数量和检出率低于正常人,提示重度苯中毒患者胸腺近期输出功能存在部分缺陷和低下的情况。

外周血T细胞受体删除环(TRECs)定量测定在评估骨髓移植术后免疫重建中的应用概况及进展

骨髓移植成功的关键在于移植后免疫系统的重建状况,特别是T细胞数量及功能的重建。T细胞受体删除环(TRECs)作为胸腺近期输出naive T细胞含量的标志,在细胞中十分稳定,可作为评价胸腺近期的输出功能及T细胞免疫重建状况的指标。鉴于TRECs对评价骨髓移植术后免疫重建状况具有重要现实意义,该文就TRECs的定量检测及其在评价骨髓移植后免疫重建状况中的应用概况及进展进行综述。

利用人体外周血痕sjTREC含量推断个体年龄

目的验证人外周血中信号结合T细胞受体删除DNA环(signal joint T-cell receptor excision DNAcircle,sjTREC)水平与年龄的相关性公式,探讨其在鉴定实践中的应用价值。方法收集已知年龄的健康无关个体外周血痕样品30例,室温放置4周后,分别提取血痕DNA。通过实时荧光定量PCR技术,定量测定外周血痕DNA中sjTREC含量,并选择人TATA盒结合蛋白(TATA box binding protein,TBP)序列作为内参基因。采用年龄推断公式Age=-7.1815Y-42.458±9.42(Y=dCtTBP-sjTREC)推算血痕的供体年龄,并与供体实际年龄作比较,验证方法准确性。结果在收集的30例血痕样品中均能检测到目的基因sjTREC和内参基因TBP。外周血痕sjTREC含量随供体年龄的增长而降低(P<0.01)。采用本方法推断血痕个体年龄的准确率为76.67%。结论利用sjTREC含量推断血痕个体年龄的方法简单、快速、灵敏、种属特异性好,具有重要的应用前景。

实时荧光定量PCR检测外周血TREC的方法研究

目的建立及优化检测移植后患者外周血TREC拷贝数的实时荧光定量PCR(FQ-PCR)的方法及实验影响条件,为临床研究造血干细胞移植的免疫功能重建机制提供方法学基础。方法在ABI7000PCR仪上实时扩增检测构建的TREC质粒标准品,摸索最佳扩增条件及建立标准曲线,然后用优化的FQ-PCR方法检测临床样本。结果T3、T4引物和R3、R4引物的扩增效率分别优于T1、T2引物和R1、R2引物。TaqMan-MGB探针比普通的TaqMan探针扩增效率高。金牌热启动Taq酶,比较普通Taq酶而言,提高了PCR的特异性和敏感性。FQ-PCR的反应条件设定:95℃10min后95℃5s,53℃30s,40循环结束。结论通过摸索与优化实验条件,建立了实时荧光定量PCR检测外周血单个核细胞中TREC的方法。

人外周血sjTREC水平与年龄的相关性调查

目的探讨人外周血中sjTREC水平及其与年龄的相关性。方法收集225例不同年龄健康人外周血样品,抽提基因组DNA,利用实时定量PCR技术,定量测定不同年龄组外周血中sjTREC含量的分布情况。sjTREC含量与年龄的关系作相关分析;各年龄组性别差异作t检验。结果 225例外周血sjTREC含量随年龄增长逐渐减少;对0～14岁、15～54岁及55岁以上3组进行方差分析(LSD检验),差异显示有统计学意义(P<0.001);性别差异不显著;供体年龄与外周血sjTREC水平呈显著负相关,r=-0.823(P<0.001)。结论人外周血中sjTREC含量与年龄存在明显相关性,对于法医物证实践中血痕的年龄推测具有一定指导意义。

定量检测T细胞受体重排删除DNA环含量评价急性非淋巴细胞白血病患者胸腺近期输出功能

目的检测急性非淋巴细胞白血病(ANLL)患者T细胞受体重排删除DNA环(signaljoint T-cell receptor exc ision DNA c irc les sjTRECs,TRECs)的含量,从而探讨患者的初始型naive T细胞水平和胸腺近期输出功能特点。方法利用实时定量PCR(TaqM an)方法,检测77例ANLL患者外周血单个核细胞(PBMC)TRECs的水平,并根据外周血中CD3阳性率计算CD3细胞中TRECs水平。14例ANLL缓解期患者和14例正常人外周血作为对照。结果ANLL患者外周血中TRECs含量为(0.43±0.92)拷贝/1 000 PBMCs,(2.02±3.25)拷贝/1 000 CD3+细胞,明显低于正常人TRECs水平[(4.10±3.65)拷贝/1 000 PBMCs和(6.84±4.71)拷贝/1 000 CD3+细胞,P=0.0000和P=0.0001]和缓解期患者[(2.19±2.49)拷贝/1 000 PBMCs和(6.30±7.13)拷贝/1 000 CD3+细胞,P=0.0000和P=0.0005]。各亚型ANLL患者的TREC水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论绝大多数ANLL型患者胸腺近期输出naive T细胞功能明显降低,缓解期患者的胸腺近期输出功能有一定程度恢复。

胸腺输出功能的评价手段—T细胞受体重排删除环的定量分析

多年来 ,因缺乏合适的检测胸腺输出naiveT细胞的技术 ,未能明确胸腺输出功能。由于胸腺T细胞的分化始于T细胞受体 (TCR)基因的重排 ,在TCRα基因重排时 ,通过δRec和 ψJα基因片段重组形成染色体外DNA环而删除TCRδ基因 ,该删除环称为信号结合T细胞受体重排删除环 (sjTRECS)或TRECs。TRECs十分稳定 ,不扩增且随着细胞增殖而稀释 ,故近期研究认为对TRECs的定量检测可以直接地估计胸腺的输出功能。本文综述了TRECs定量分析在评价正常人和造血干细胞移植 ,血液肿瘤、HIV感染和自身免疫性疾病等等的胸腺输出功能中的作用。

苯中毒患者胸腺近期输出功能和T细胞亚群变化

目的 分析职业性慢性轻度苯中毒工人外周血单个核细胞中信号结合T细胞受体删除DNA环 (sjTRECs)的含量和CD4+/CD8+比值 ,从而了解其初始 (naive)T细胞含量和胸腺近期输功能 ,以及外周T细胞亚群分布情况。方法 利用间接免疫荧光法检测 11例健康人和 5例轻度苯中毒患者外周血单个核细胞中CD4+/CD8+比值 ;采用实时荧光定量聚合酶链反应 (real timePCR)和TaqMan方法检测两组外周血单个核细胞中sjTRECs的含量。结果 每 10 0 0个外周血单个核细胞中sjTRECs含量在正常人中为 9 10± 4 5 5 ,轻度苯中毒为 2 80± 3 79,P <0 0 5 ;轻度苯中毒者CD4+/CD8+的比值 (0 92± 0 3 5 )明显低于正常人 (1 49± 0 2 1) ,P <0 0 1。结论 轻度苯中毒患者胸腺近期输出功能低下 。

接苯工人胸腺近期输出功能和外周血T细胞亚群变化

目的分析接苯工人外周血单个核细胞中T细胞受体删除DNA环(TRECs)和T淋巴细胞亚群的含量,了解接苯后工人胸腺近期输出功能和外周T淋巴细胞亚群变化,为接苯后机体细胞免疫改变提供资料。方法利用间接免疫荧光法检测健康人和接苯工人外周血单个核细胞中CD3+,CD4+,CD8+的含量;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time PCR)和TaqMan方法检测标本外周血单个核细胞中TRECs的含量。结果在接苯工人外周血白细胞总数正常情况下,接苯组CD8+含量显著增加,CD4+/CD8+比值为(1.13±0.78),低于健康人(1.43±0.25)(P<0.05)。每1000个外周血单个核细胞中接苯组与对照组TRECs含量分别为(3.90±3.58)和(7.39±6.83),两者相比,差异有统计学意义(P<0.05)。结论长期低剂量接苯可能引起一些工人的胸腺近期输出功能低下,导致机体细胞免疫功能障碍。

异基因造血干细胞移植合并胸腺移植及CD4^--DLI后T细胞重建情况

目的评价异基因造血干细胞(allo-HSCT)联合胸腺移植(TT)时给予去除CD4^+T细胞供体淋巴细胞输注(CD4^--DLI)对T细胞重建及向外周T细胞储存库输出能力的影响。方法分为两组,对照组alloHSCT时联合TT,处理组allo-HSCT时联合TT及CD4^--DLI,移植5个月后提取小鼠脾脏T细胞的基因组DNA,以实时定量PCR检测小鼠脾脏T细胞中信号结合T细胞受体重排删除环(sjTRECs)水平,PCR扩增目的基因与RAG_2片段,建立PCR标准曲线并比较对照组和处理组脾脏T细胞sjTRECs含量。结果对照组和处理组的脾脏T细胞sjTRECs水平差异有统计学意义,处理组显著高于对照组(P<0.01)。结论 allo-HSCT+TT时给予CD4^--DLI能够显著加快移植后T细胞重建及向外周T细胞储存库输出能力的恢复。

TRECs联合CD31^+调节性T细胞检测用于分析慢性乙型肝炎患者的胸腺新近输出功能

目的探讨T细胞受体重排删除环(TRECs)联合CD31^+调节性T细胞(Treg)检测在评价慢性乙型肝炎(CHB)患者胸腺新近输出功能的临床应用价值。方法实验分4组:轻度慢性乙型肝炎患者(MildCHB)组35例、中度慢性乙型肝炎患者(ModerateCHB)组35例,重度慢性乙型肝炎患者(SevereCHB)组35例,健康对照(HCs)组30例,利用磁性细胞分离法分离各组CD4+CD25+Treg,流式细胞分析法检测各组外周血中CD31^+Treg占Treg细胞的比例,应用实时荧光定量PCR技术检测CD4+CD25+Treg中TRECs的数量,同时常规检测CD3^+/CD4^+/CD8^+等指标。结果ModerateCHB组和SevereCHB组外周血CD31^+Treg/Treg、TRECs的数量明显低于MildCHB组和HCs组(P<0.05);而MildCHB和HCs组间比较,差异无统计学意义(P>0.05);CD3^+/CD4^+/CD8^+在4个实验组中比较差异均无统计学意义(P>0.05)。CHB患者中CD31+Treg/Treg与TRECs的数量呈正相关(r=0.551,P=0.014)。结论ModerateCHB和SevereCHB人群中CD31^+Treg/Treg、TRECs含量减少;CD31^+Treg/Treg与TRECs含量呈正相关,是评价胸腺新近输出功能的新指标。

新生儿重症联合免疫缺陷病分子检测的研究进展

重症联合免疫缺陷病(SCID)是首个纳入新生儿疾病筛查的先天性免疫缺陷病。新生儿SCID分子筛查技术的发展为SCID的早期诊断和治疗提供了更加可靠的手段。但是,分子检测技术也面临着安全性、成本效益等挑战。本文对SCID分子检测技术的优势及挑战进行综述,以为我国新生儿SCID检测提供参考。

重度苯中毒患者胸腺输出近期功能明显低下

本研究目的在于分析重度苯中毒患者外周血单个核细胞中T细胞受体删除DNA环 (T cellreceptorexci sionDNAcircle ,TREC)的含量 ,从而了解其初始 (naive)T细胞的含量和胸腺近期输出功能。利用实时定量PCR和TaqMan方法检测 8例重度苯中毒患者和 16例正常人外周血单个核细胞 (PBMNC)中TREC的水平。结果显示正常人中TREC含量为 :6 .6 9± 4 .79 10 0 0PBMNC ;而重度苯中毒患者则为 1.0 3± 0 .4 4 10 0 0PBMNC ,显著低于正常人TREC水平 (P <0 .0 1) ,并持续苯中毒的全过程 ,即使在外周血血象基本恢复正常时 ,TREC水平仍处于较低状态。结论 :重度苯中毒患者胸腺近期输出功能明显低下 ,苯中毒明显损伤T细胞免疫功能。

实时定量PCR评价小鼠胸腺功能方法的建立

目的建立实时定量PCR检测小鼠胸腺及脾脏T淋巴细胞中信号结合T细胞受体删除环(sjTRECs)水平的方法,推测其中的初始T细胞的数目,评价胸腺功能,从而为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。方法提取小鼠胸腺和脾脏淋巴细胞基因组DNA,PCR扩增目的片段。纯化构建标准质粒的RAG2片段,构建标准重组质粒并鉴定。优化PCR体系后,实时定量PCR反应建立标准曲线,并检测不同品系(BALB／c和C57BL／6)成年小鼠胸腺及脾脏淋巴细胞sjTRECs含量。结果成功构建标准质粒。确定最适实时定量PCR反应条件后,在实时定量PCR中建立可信度高的标准曲线。建立的方法分析表明,这两个不同品系的sjTRECs含量统计学差异不显著。结论成功建立定量检测小鼠T淋巴细胞中sjTRECs含量从而推测其中的初始T细胞数目的方法,为胸腺功能研究及胸腺研究模型的建立提供研究依据和方法。

实时荧光定量PCR检测正常人外周血sjTREC含量的研究

目的采用实时荧光定量PCR方法,分析正常人各年龄段外周血中sjTREC的含量,为客观评价胸腺输出功能提供方法学基础。方法构建sjTREC质粒标准物,建立标准曲线,在ABI7500PCR仪上实时扩增检测229例(男147例,女82例)各年龄组正常人外周血样本中sjTREC片段,计算每毫升血液中所含的sjTREC拷贝数(sjTREC copies/ml),结果取对数值。sjTREC含量与年龄的关系做相关分析;男、女性sjTREC含量差异做t检验。结果 229例外周血sjTREC含量随年龄增长逐渐减少;对0～14岁、15～54岁及≥55岁三组进行方差分析(LSD检验),显示差异有统计学意义(P<0.0001);15～54岁组内男、女性sjTREC水平差异有统计学意义。结论建立了实时荧光定量PCR检测外周血sjTREC含量的方法,分析并提供了正常人各年龄组外周血中sjTREC含量,初步建立了正常人sjTREC水平的数据库,为客观评价胸腺输出功能提供了依据。

造血干细胞移植患者动态监测胸腺输出功能的意义

目的观察造血干细胞移植患者胸腺近期输出功能的动态变化情况,分析其相关影响因素,从而了解移植后T细胞免疫重建情况。方法选择2007年1月~2012年6月于北京大学深圳医院接受造血干细胞移植的血液病患者41例,采用实时荧光定量PCR方法检测患者不同时期200μL外周血中T细胞受体重排DNA删除环（sjTREC）水平,计算每毫升血液中sjTREC拷贝数。同时检测32例年龄匹配的正常者外周血T细胞受体重排DNA删除环含量作为正常对照。比较患者造血干细胞移植后sjTREC随时间变化情况。结果 32例正常对照组外周血Log sjTREC/mL为3.78±0.22,它与年龄呈负相关（r=-0.59,P〈0.05）。41例移植患者移植前外周血sjTREC水平显著低于正常对照组,移植后外周血sjTREC进一步下降,移植6个月后TRECs逐渐升高,移植后1.5年基本恢复至移植前水平,移植后2.5年恢复至接近正常水平。反复化疗可使患者胸腺输出功能下降。不同年龄组患者移植后胸腺输出功能恢复差异无统计学意义（P〉0.05）。移植6个月后,自体造血干细胞移植组患者外周血sjTREC水平恢复快于异基因移植组（P〈0.05）,至移植后2年二者差异无统计学意义（P〉0.05）。移植1年后存在广泛型cGVHD的患者其外周血sjTREC水平下降,低于无cGVHD者（P〈0.05）。结论造血干细胞移植后T细胞免疫重建缓慢,并受多种因素影响。胸腺输出功能可作为评价移植后免疫重建的有效指标。

抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群的胸腺近期输出功能初步探讨

目的观察抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群外周血单个核细胞(PBMCs)中T细胞受体重排删除环(TRECs)的含量,从而推测其胸腺近期输出功能。方法利用实时荧光定量PCR方法检测30例抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群及22例正常人PBMCs中TRECs含量。结果抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群中TRECs含量为(5.67±1.55)cop ies/103PBMCs,与正常人TRECs水平(6.11±2.11)cop ies/103PB-MCs无差异(P>0.05)。结论抗-HBs、抗-HBe和抗-HBc阳性人群TRECs水平情况显示其胸腺近期输出功能与正常人比较无差异。