血清sLOX-1、ESM-1对急性缺血性脑卒中患者rt-PA静脉溶栓后发生出血转化的预测价值

目的探讨血清可溶性凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(sLOX-1)、内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)对急性缺血性脑卒中(AIS)患者重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)静脉溶栓治疗后发生出血转化(HT)的预测价值。方法选择2020年1月至2022年6月在宝鸡市人民医院接受rt-PA静脉溶栓治疗的AIS患者320例为研究对象,根据治疗后头颅CT复查结果分为HT组和非HT组,采用酶联免疫吸附试验检测两组患者的血清sLOX-1、ESM-1水平,并进行比较;采多因素Logistic回归分析rt-PA静脉溶栓后发生HT的影响因素;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清sLOX-1、ESM-1对rt-PA静脉溶栓后发生HT的预测价值。结果治疗36 h后,47例患者发生HT(HT组),HT发生率为14.69%(47/320),剩余273例未发生HT患者为非HT组。HT组年龄、合并高血压患者占比、入院时NIHSS评分、治疗前血清sLOX-1和ESM-1水平高于非HT组(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,入院时NIHSS评分>13.04分、血清sLOX-1>0.92 ng/mL、血清ESM-1>1.24μg/mL是AIS患者静脉溶栓后发生HT的独立危险因素(P<0.05)。治疗前血清sLOX-1、ESM-1单独及联合检测预测rt-PA静脉溶栓后发生HT的曲线下面积(AUC)分别为0.797、0.775和0.840。结论血清sLOX-1、ESM-1是AIS患者rt-PA静脉溶栓后发生HT的影响因素,二者联合检测对其具有较高的预测价值。

东亚飞蝗DSCAM2多克隆抗体制备

制备唐氏综合征细胞粘附分子2(DSCAM2)多克隆抗体,拟为DSCAM2功能探索提供免疫学工具。采用生物信息学方法对DSCAM2抗原结构进行分析;利用DNA重组技术构建DSCAM2828-957重组表达菌株;采用Ni亲和层析技术纯化重组DSCAM2828-957蛋白,免疫小鼠制备Anti-DSCAM2多克隆抗体;采用ELISA法检测抗体效价、Western Blot法检测抗体特异性、瑞氏-吉姆萨染色和免疫荧光检测DSCAM2在东亚飞蝗血淋巴细胞定位;采用siRNA敲低DSCAM2,进行血淋巴细胞计数。结果表明,所构建的pET30a(+)-DSCAM2828-957/BL21(DE3)原核菌株成功表达重组DSCAM2828-957蛋白;用Ni螯合亲和层析分离获得的DSCAM2828-957重组抗原免疫小鼠,获得了效价高且特异性好的DSCAM2多克隆抗体;细胞定位分析显示DSCAM2在东亚飞蝗嗜碱性粒细胞高表达;敲低DSCAM2表达水平,引起东亚飞蝗总血淋巴细胞数量增多。

炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白ATR-Fc在CHO细胞中的表达

ATR_Fc是人炭疽毒素受体(ATR)的胞外区与人免疫球蛋白IgG1的铰链区、CH2区和CH3区组成的融合蛋白。表达该蛋白是为了获得结合PA的抗体样分子,通过阻断PA与细胞受体的结合,而阻止炭疽致死毒素和水肿因子进入细胞内,可作为预防和治疗炭疽感染的生物制品。将编码炭疽毒素受体N端1_227氨基酸的基因和编码Fc段的基因连接,插入到pcDNA3.1的HindⅢ和NotⅠ位点得到表达ATR_Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1ATR_Fc,并用脂质体方法将该载体转染至CHO_K1细胞中,用G418筛选并获得ATR_Fc表达水平为10～15μg(106cells·d)的基因工程CHO细胞系ATR_Fc_1D5。采用蛋白A纯化重组蛋白,并用ELISA法鉴定ATR_Fc与PA的亲和性,表明ATR_Fc可与PA特异性结合。

DcR3重组蛋白对糖尿病大鼠心肌组织凋亡相关分子的表达及细胞凋亡的作用

目的:研究诱骗受体3(DcR3)在正常大鼠、糖尿病(DM)大鼠心肌组织的表达,DcR3重组蛋白对心肌组织凋亡相关分子表达以及心肌细胞凋亡的影响,探讨DcR3对DM大鼠心肌细胞凋亡的作用。方法:一次性腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠DM模型,尾静脉注射不同剂量的DcR3重组蛋白[1.2 mg/(鼠·d)、0.8 mg/(鼠·d)、0.4 mg/(鼠·d)]40 d。RTPCR检测心肌组织DcR3 mRNA、Fas mRNA、FasL mRNA的表达。Wester blot分析凋亡相关蛋白Bcl-2、Caspase-8的表达。双抗夹心ELISA检测血液中IL-1β、TNF-α及LFN-γ水平的变化,HE染色观察心肌细胞凋亡的百分率。结果:DcR3治疗组大鼠与DM组比较心肌组织DcR3 mRNA高表达,Fas mRNA、FasL mRNA表达下调。Caspase-8蛋白水平下调,Bcl-2蛋白水平上调,以中剂量组的作用最明显。各DcR3治疗组血清IL-1β、TNF-α和IFN-γ水平均有不同程度的降低(P<0.05,P<0.01)。心肌细胞凋亡的百分率下降(P<0.05)。结论:DcR3重组蛋白有抑制DM大鼠心肌细胞凋亡的作用,其机制与竞争Fas,阻断FasL诱导细胞凋亡,心肌细胞表达DcR3,凋亡相关因子Caspase-8下调、Bcl-2上调及细胞因子水平的降低有关。

重组人粒细胞集落刺激因子对中性粒细胞及其表面分子表达的影响

目的了解重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的使用对健康人外周血中性粒细胞比例及其细胞黏附分子和趋化因子受体的影响。方法给健康人注射rhG-CSF前后,用流式细胞仪检测外周血中性粒细胞表面分子的表达。结果注射rhG-CSF前中性粒细胞在外周血白细胞中所占比例的中位数为60%,注射后为85%,注射前后有显著差异(P<0.01)。注射rhG-CSF前中性粒细胞CD62L、CD49d的表达率中位数分别为82.84%和23.03%,注射后分别为18.30%和43.70%。注射后分别降低和升高(P<0.01)。注射rhG-CSF前后外周血中性粒细胞CD44、整合素CD11 a表达率无显著变化(P>0.10)。结论注射rhG-CSF可使健康人中性粒细胞的比例升高,CD49d表达率升高,CD62L表达率下降。

长效重组蛋白药物的研究进展

重组蛋白药物经静脉和皮下注射后通常半衰期较短,目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理:1、增大蛋白药物分子量;2、利用血浆药物平衡;3、减少免疫原性。针对构建突变体、PEG化修饰和与血清白蛋白融合三种延长重组蛋白药物半衰期的方法,及其已上市的和正在研发中的长效重组蛋白药物的特征、半衰期和免疫原性问题进行了综述。

融合蛋白NrCAM-Fc的重组体的构建

目的 :构建神经原相关的细胞粘附分子 (NrCAM )和免疫球蛋白Fc片段融合基因的重组质粒并通过Baculovirus载体转染到昆虫细胞。方法 :利用RT PCR方法从神经母细胞瘤细胞系SK N SN获得NrCAM的信号肽区和跨膜区片段并直接克隆到 pGEMT载体 ,经多次酶切、连接、转化、筛选获得NrCAM Fc的重组融合基因 ,测序后将此基因通过Baculovirus载体转染至昆虫细胞。结果 :多种酶切和测序结果表明NrCAM Fc的序列与原序列符合率达 98%以上 ,NrCAM与Fc连接处序列保证了Fc的读码框架 (ORF)。结论 :Baculovirus载体转染效率高 。

重组人生长激素对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的探讨重组人生长激素(rhGH)对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用及其机理。方法Pringle法建立100只肝脏缺血再灌注损伤动物模型,rhGH组于建立模型前7d每天给予rhGH针剂皮下注射(0.2U/100g体重),对照组等量生理盐水注射,观察其血清ALT、TNF-α和IL-1α的变化,检测肝细胞中丙二醛(MDA)、肝脏能荷(energycharge,EC)的变化及核转录因子-κB(NF-κB)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表达,电镜观察肝脏的超微结构变化。结果rhGH组ALT、TNF-α、IL-1α和MDA在各个时间点的水平均明显低于对照组(P<0.05),rhGH组EC水平明显高于对照组(P<0.05);rhGH组肝细胞核因子NF-κB表达及ICAM-1mRNA的表达水平均明显低于对照组(P<0.05)。对照组电镜下可见肝窦内皮细胞破坏,肝细胞线粒体结构改变,rhGH组肝细胞超微结构明显改善。结论rhGH可能通过下调NF-κB的表达,进一步抑制了细胞因子(TNF-α、IL-1α)和ICAM-1致炎因子mRNA的表达,减少MDA的生成,从而减轻了这些因子对肝脏的损伤。

重组人生长激素对大鼠急性胰腺炎的治疗作用

目的观察重组人生长激素(rhGH)对大鼠急性胰腺炎(AP)的治疗并探讨其机制。方法ipE.coli复制大鼠AP模型。42只健康♀SD大鼠随机分为对照组(C组)、急性胰腺炎组(AP组)及rhGH治疗组(T组)。AP、T组再按观察时点分为1、3 d两个亚组。C组ip 15 m.lkg-1生理盐水;AP组ip 15 m.lkg-1E.coli(1×1010CFU.L-1)后立即im生理盐水;T组于ipE.coli后立即im 2.25 U.kg-.1d-1rhGH。观察胰腺的病变程度并进行评分,测定血清淀粉酶的活性,免疫组化检测胰腺组织中ICAM-1蛋白的表达及NF-κB核的阳性率。结果AP两亚组胰腺组织病理评分、血清淀粉酶活性、ICAM-1蛋白表达及NF-κB核阳性率均明显高于C组水平(P<0.05);rhGH治疗能明显降低上述指标水平,尤以T3d组降低最为显著。结论rh-GH治疗能明显减轻大鼠急性胰腺炎的损伤程度,其机制可能与降低NF-κB活化程度及ICAM-1蛋白的表达水平等有关。

重组胸腺素β4调节ICAM-1、MMP-2和LN-5促进创伤愈合的实验研究

目的探讨重组胸腺素β4(Thymosin β4,Tβ4)通过改善创面基质环境促进大鼠皮肤创伤愈合的作用机制。方法在大鼠背部制作直径8mm的全层皮肤损伤模型,动物分为对照组(PBS)、Tβ4低剂量组、Tβ4中剂量组、Tβ4高剂量组,每组5只,每天两次给药,2d、4d、7d取材,行ICAM-1(Intercellular adhesion molecule-1)、MMP-2(Matrix metallopoproteinase-2)、LN-5(Laminin-5)的免疫组化并进行平均积分光密度(IOD)分析。结果经Tβ4处理后的创面,ICAM-1阳性表达多,早期中、高剂量组表达较强(p<0.01),中期均减弱,高剂量组相对较强;晚期各组表达增强,高剂量组最强(p<0.01)。MMP-2早期对照组表达最高(p<0.01),高剂量组最弱(p<0.01);中期中剂量组表达明显(p<0.05);晚期基质阳性明显增多,对照组表达最强(p<0.01),高剂量组最弱(p<0.01)。LN-5早期各组均可见较多的阳性表达,对照组与低剂量阳性强(p<0.01),中剂量组阳性最少;中期中剂量组表达最强(p<0.01);晚期中剂量组仍然有较强的阳性表达(p<0.01)。结论Tβ4可能是通过调节ICAM-1、MMP-2、LN-5的表达,改善创面基质环境,促进皮肤创伤愈合。

五指山小型猪诱导多能干细胞的前景分析

作者概述了五指山小型猪在生命科学和医学研究上所具有的独特优势,分析了目前猪诱导多能干细胞技术发展现状和存在的问题,阐明了采用重组蛋白和小分子化合物诱导多能干细胞的优势,展望了五指山小型猪诱导多能干细胞的发展前景。

pHBAd-MCMV-GFP-NCAM1真核表达质粒的构建和鉴定

目的将目的基因NCAM1与质粒载体p HBAd-MCMV-GFP进行连接,得到重组质粒p HBAd-MCMV-GFPNCAM1。方法对目的基因和质粒载体分别用内切酶Not I和Nsil进行双酶切,产物回收后进行连接、转化,得到重组质粒p HBAd-MCMV-GFP-NCAM1。转化后的菌液进行PCR阳性克隆鉴定,并对阳性样本进行测序。结果首先对NCAM1进行扩增,从实验结果看符合预期效果,在双酶切、连接和转化实验后,对构建完成的重组质粒进行鉴定,PCR阳性克隆鉴定结果显示重组质粒构建成功,NCAM1已连接进入重组质粒中,测序的结果进一步印证阳性鉴定结果。结论带有目的基因NCAM1的重组质粒构建成功。

噬菌体展示库筛选构建血管细胞黏附分子-1单链抗体及其效价检测

目的从噬菌体重组抗体库中筛选获得靶向血管细胞黏附分子-1（Vcam-1）的单链抗体,纯化浓缩后进行亲和性鉴定,并与单克隆抗体效价进行比较。方法扩增Vcam-1基因克隆质粒并转入真核细胞中表达获得Vcam-1抗原蛋白,纯化后包被免疫管,通过4轮压力逐渐增大的＂吸附-洗脱-扩增＂过程筛选获得阳性克隆。对阳性克隆进行ELISA检测,选取效价高的克隆送予测序并转入大肠埃希菌进行表达,认定高表达的样品为最终的阳性克隆。将该阳性克隆转染入感受态细胞表达单链抗体,纯化后经ELISA检测并评价其抗原亲和性。结果真核细胞表达的Vcam-1抗原蛋白的分子量为85~90kD。以Vcam-1抗原蛋白为免疫原筛选4轮所得的阳性克隆进行单噬菌体ELISA检测,从检测结果中选取9个效价高的克隆经基因测序共获得3个序列,其中1个序列对应的克隆高表达。表达的单链抗体分子量约30kD,ELISA检测其对Vcam-1抗原蛋白有较高亲和性,效价较单克隆抗体低。结论利用噬菌体展示技术获得了靶向Vcam-1的单链抗体,为随后的诊断和治疗应用奠定了基础。

以重组sICAM-1 I～Ⅲ功能区蛋白作抗原制备抗体建立人血清sICAM-1 RIA

目的 :探讨用重组可溶性细胞间黏附分子 -1(sICAM -1)I～Ⅲ功能区蛋白免疫家兔制备抗体 ,及用其建立人血清sICAM -1放免方法 (RIA)。方法 :对获得的抗体和建立的RIA方法学进行鉴定。测定214例正常人和38例初诊Grave's病 (GD)患者的sICAM -1。结果 :抗体的亲和常数为1 056×108L/mol ,最终稀释度为1∶14000。灵敏度为1 4μg/L ;非特异结合<5.0 % ;批内变异<5 % ,批间变异<8 % ;样品平均回收率为102 52 % ;平行实验的稀释曲线与标准曲线基本平行 ,参考值范围 (x±2s)为 (175 15±66 88) μg/L ,各年龄、性别组间差别无统计学意义(P>0.05) ,初诊GD患者血清sICAM -1显著高于对照组(P<0.01)。结论 :成功制备出抗体 ,用其建立了人血清sICAM -1RIA 。

小鼠重组Periostin C端肽在大肠杆菌中的表达及其产物的活性检测

目的 :利用大肠杆菌系统表达小鼠重组PeriostinC端肽。方法 :将编码小鼠PeriostinC端肽的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pRSET -B上 ,使其受控于T7启动子 ,构建成表达质粒pRS -B -Peri,以大肠杆菌E .coliBL2 1(DE3)为宿主菌。对工程菌用异丙基硫代 - β -D -半乳糖苷 (isopropylthio - β -D -galacto side ,IPTG)诱导表达 ,表达产物纯化后进行复性处理 ,再通过观察成骨细胞的伸展性检测其生物活性。结果 :经IPTG诱导 5h ,工程菌在SDS -PAGE上出现一条新蛋白带 ,相对分子质量 (Mr)与预期的一致 ,约为 36 0 0 0 ,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化和复性处理 ,得到纯度高于 95 %的有良好活性的小鼠重组PeriostinC端肽。结论 :小鼠重组PeriostinC端肽在大肠杆菌中得到表达并具有良好的生物学活性。

小分子化合物靶向DNA连接酶Ⅳ提高CRISPR/Cas9基因编辑效率的研究进展

基因编辑工具能够在DNA链上制造特定位点双链断裂(Double-strand breaks,DSB)。细胞内具有修复DSB的2种不同途径,即同源重组(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)。NHEJ与HDR之间相互竞争,互为替代DNA修复途径。DNA连接酶Ⅳ参与NHEJ途径并发挥重要作用。DNA连接酶Ⅳ抑制剂可以抑制DNA修复通路中NHEJ的效率,同时可以提高HDR的效率。为了优选小分子化合物实现更有效的基因定点插入,综述了SCR7、NU7026、白藜芦醇、L755507这4种不同的小分子化合物在CRISPR/Cas9基因编辑效率上的研究,归纳了这4种小分子化合物在其中发挥的作用,并用生物信息学软件模拟所用小分子化合物与DNA连接酶Ⅳ的对接。在此基础上,对这4种小分子化合物提高基因编辑效率的研究前景进行了展望。

弓形虫ZS株P22基因片段的克隆、表达与融合蛋白的纯化

目的 克隆弓形虫 ZS株表面抗原 P2 2编码基因 ,构建原核重组表达质粒 p Thio His A,B,C/ P2 2 ,并在大肠杆菌 (Top10 )中进行表达及纯化融合蛋白。 方法 PCR扩增及限制性内切酶 Pst 和 Bgl 双酶切 4 96 bp的弓形虫表面抗原 P2 2编码基因目的片段 ,胶回收纯化 ,插入表达质粒载体 p Thio His A,B,C多克隆位点 ,构建重组体p Thio His A,B,C/ P2 2 ,并转化大肠杆菌 (E.coli) Top10 ,筛选阳性克隆 ,以限制性酶切分析及测序鉴定后 ,以异丙基硫代β- D-半乳糖苷 (IPTG)进行诱导 ,在 E.coli Top10中表达 ,用 SDS- PAGE与免疫印迹分析表达产物并纯化。 结果 PCR扩增出约 4 96 bp的 P2 2编码基因目的片段 ,与预期片段大小相符 ;所构建的 p Thio His A,B,C/ P2 2重组体阳性克隆经双酶切与测序鉴定 ,与预期结果一致 ;SDS- PAGE与免疫印迹显示 ,表达融合蛋白产物约 35 .4 k D。 结论 成功构建弓形虫 ZS株表面抗原 P2 2编码基因 p Thio His A,B,C/ P2 2表达质粒 ,诱导表达弓形虫表面抗原 P2 2蛋白 。

人扁桃体淋巴细胞cDNA质粒重组体的构建

目的；通过构建人扁桃体淋巴细胞ｃＤＮＡ质粒重组体，为深入研究淋巴细胞的生物学功能奠定实验基础。方法：采用ＤＮＡ重组技术，以人新鲜扁桃体淋巴细胞为实验材料从中提取ｍＲＮＡ，以ｍＲＮＡ为模板合成ｃＤＮＡ，然后与质粒ｐＳＰＯＲＴＩ进行定向连接并转入到Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９中进行了分子克隆。结果：阳性克隆玷９０％，阴性克隆占１０％，转化率为１．３５×１０＾４克隆／微升连接体系，插入片段长度为０．５－２．

PE重组免疫毒素在肿瘤导向治疗中的应用

绿脓杆菌外毒素A(PE)经过修饰后失去了与细胞结合的能力,将单克隆抗体的Fv段或细胞因子作为导向分子与修饰后的PE通过DNA重组技术融合,获得重组的免疫毒素,这种免疫毒素通过导向分子将毒素带到靶细胞,并杀伤靶细胞,因而被广泛运用于肿瘤的导向治疗。

RecA蛋白介导同源重组的步进式链交换

同源重组过程由重组酶介导,对维持细胞的遗传稳定性有极大的作用.链交换是同源重组的关键过程,研究链交换发生的基本步长对理解整个反应机制有着重要的作用.RecA作为原核生物重组酶的重要成员,近年来持续受到广泛关注,但RecA介导的同源重组链交换的步长目前还有争议.现在主流的观点认为链交换步长为3 bp,而我们的前期工作测得步长的最可几值为9 bp.为了进一步验证我们的结论,进而为更深层次的机理研究提供基础,本文采用酶切保护实验和单分子磁镊,配合使用不同的错配碱基序列从侧面验证了链交换步长不为3 bp,而更倾向于9 bp,并分析了一个步长内的错配碱基数目和分布对链交换进程的影响.该结论为进一步探索重组酶工作的分子机理提供了基础和新的思路.