谷氨酸通过T1R1/T1R3-ERK1/2通路调节香猪睾丸间质细胞自噬相关基因表达

【目的】探究L-谷氨酸刺激对香猪睾丸间质细胞自噬的影响,为进一步研究味觉受体T1R1/T1R3通过雷帕霉素靶蛋白(mTOR)调控下自噬对雄性生殖的影响提供理论依据。【方法】选取30日龄的健康从江香猪分离培养睾丸间质细胞,采用不同浓度L-谷氨酸刺激睾丸间质细胞T1R1/T1R3,探究激活T1R1/T1R3对睾丸间质细胞自噬相关基因(TAS1R1、TAS1R3、ERK1、ERK2、mTOR、Beclin 1和MAP1LC3B)表达的影响。【结果】从江香猪睾丸间质细胞在培养72~96 h增殖最快,于培养96 h时达对数生长期。10 mmol/L是L-谷氨酸刺激睾丸间质细胞味觉受体T1R1/T1R3的有效浓度。经10 mmol/L的L-谷氨酸刺激后,睾丸间质细胞的mTOR、ERK1和ERK2基因相对表达量极显著高于对照组(P<0.01,下同),而Beclin 1基因相对表达量极显著低于对照组,MAP1LC3B基因相对表达量显著低于对照组(P<0.05,下同);ERK1/2和p-S6K1蛋白相对表达量显著高于对照组,而Beclin 1蛋白相对表达量显著低于对照组。单丹磺尸酰胺(MDC)染色结果显示,经10 mmol/L的L-谷氨酸刺激后,睾丸间质细胞内的酸性自噬泡荧光强度明显低于对照组,表明胞内自噬受抑制。【结论】10 mmol/L的L-谷氨酸可激活从江香猪睾丸间质细胞T1R1/T1R3,且自噬相关基因TAS1R1、TAS1R3、ERK1、ERK2和mTOR及相关蛋白T1R1、T1R3、ERK1/2、p-S6K1和p-mTOR表达升高,而Beclin 1和MAP1LC3B基因及Beclin 1蛋白表达降低,故推测谷氨酸可通过激活味觉受体T1R1/T1R3参与雄性生殖自噬的负调控。

味觉受体T1R1和T1R3在从江香猪附睾不同区段的差异表达

【目的】明确从江香猪附睾中不同区段味觉受体T1R1和T1R3的定位及表达情况,为揭示猪附睾不同区段形成特殊微环境保障精子成熟的作用机制提供参考依据。【方法】采集初情期(30d)和性成熟期(180d)从江香猪附睾组织样品,分别采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学、蛋白免疫印迹(Western blotting)等检测从江香猪附睾不同区段味觉受体T1R1和T1R3的定位及表达情况。【结果】味觉受体T1R1/T1R3的编码基因TAS1R1/TAS1R3均表现为附睾Ⅳ区的相对表达量显著高于其他区段(P<0.05,下同),而Ⅰ区的相对表达量显著低于其他区段,具体排序为Ⅳ区>Ⅴ区>Ⅱ区>Ⅲ区>Ⅰ区。免疫组织化学定位分析结果显示,在从江香猪附睾不同区段均检测到T1R1/T1R3不同程度的免疫阳性信号。其中,T1R1在附睾Ⅰ区主要定位于肌样细胞层与基细胞核;在附睾Ⅱ区主要定位于附睾上皮细胞、肌样细胞和精子细胞;在附睾Ⅲ区强烈定位于附睾管腔和微绒毛根部;附睾Ⅳ区为5个区段中表达最强烈的部位,定位于附睾管腔精子、管腔内缘和狭窄细胞膜上;在附睾Ⅴ区主要定位于附睾间质组织和狭窄细胞膜上。T1R3定位于附睾Ⅰ区血管内皮细胞、脱落生精细胞和附睾上皮细胞(尤其是基细胞);在附睾II区的精子、晕细胞和狭窄细胞上有较强表达;在附睾Ⅲ区和Ⅳ区主要定位于空泡化的附睾上皮细胞;在附睾Ⅴ区定位于附睾管不规则处和空泡化附睾上皮细胞,其表达强度仅次于Ⅲ区。Western blotting检测结果显示,从江香猪附睾Ⅳ区的T1R1/T1R3表达水平最高,其次是Ⅱ区,二者显著高于其他区段。【结论】初情期从江香猪附睾T1R1和T1R3的表达具有区段特异性和细胞特异性,以Ⅳ区的表达水平最高,且主要定位于附睾上皮细胞顶端、狭窄细胞和微绒毛根部,提示T1R1/T1R3在建立促进猪附睾精子成熟和储存的特殊腔内微环境中发挥重要作用。

T1R1和T1R3在从江香猪附睾发育中的表达模式

为研究味觉受体第一家族亚型1(T1R1)和3(T1R3)在从江香猪附睾发育过程中的表达模式,探讨味觉受体在哺乳动物雄性生殖机能中可能发挥的作用及潜在医学价值,本试验以从江香猪附睾组织为研究对象,分析附睾发育4个关键时期:初情前(15 d)、初情时(30 d)、初情后(60 d)和性成熟期(180 d)T1R1与T1R3的差异表达。采用实时荧光定量PCR、免疫组织化学(IHC)和Western blot检测两个味觉受体在不同日龄从江香猪附睾组织中转录、翻译水平的变化及其分布情况。RT-qPCR结果表明:TAS1R1与TAS1R3 mRNA在从江香猪附睾初情前(15 d)至性成熟期(180 d)表达量逐渐增加,且任意两个时期间差异极显著(P<0.01)。Western blot结果显示,T1R1/T1R3蛋白在180 d表达量最高,在15 d表达量最低,两者之间差异显著(P<0.05),平均表达丰度依次为180 d>30 d>60 d>15 d。IHC结果显示,T1R1和T1R3蛋白在各日龄组从江香猪附睾组织均有分布,其中T1R1蛋白主要在上皮细胞膜上,尤其是基细胞和窄细胞;而T1R3蛋白主要在微绒毛、环状空泡和精子呈强阳性表达。综上,本研究发现不同日龄从江香猪附睾的T1R1/T1R3表达从15 d逐渐增加,至性成熟达到峰值,这一表达变化与附睾上皮基细胞和窄细胞及微绒毛的T1R1/T1R3的差异表达有关,这些特殊的表达模式与附睾生理功能存在时间关联,故推测T1R1和T1R3参与附睾内精子成熟和储存的调节过程。

湖羊消化道各段T1R1、T1R3及PepT1基因表达水平的分析

为分析T1R1(味觉受体1家族Ⅰ型)、T1R3(味觉受体1家族Ⅲ型)及PepT1(Ⅰ型寡肽转运载体)基因对湖羊氨基酸吸收的影响,以6月龄的湖羊为试验材料,采用荧光定量PCR技术对湖羊瘤胃、网胃、瓣胃、皱胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠和直肠的T1R1、T1R3和PepT1基因的表达量进行相对定量分析。结果表明:T1R1和T1R3基因在检测的各段组织中均有表达,而PepT1基因在结肠中不表达;其中T1R1和T1R3基因在十二指肠中表达量最高,其次是空肠,并且两者差异显著极显著(P<0.01);T1R1和T1R3基因在十二指肠(P<0.01)和空肠(P<0.05)中的表达量与消化道其他部位相比差异极显著或显著;Pep T1基因在空肠中表达量最高,其次是回肠,并且两者差异极显著(P<0.01);Pep T1基因在空肠和回肠中的表达量与消化道其他部位相比差异极显著(P<0.01)。该结果为进一步研究T1R1、T1R3和Pep T1基因对湖羊氨基酸吸收相关功能影响奠定基础。

动物鲜味受体的研究进展及其基因表达调控

动物的鲜味受体包括代谢型谷氨酸受体(m GluR)和味觉受体异源二聚体(T1R1/T1R3),是C型G蛋白偶联受体,N末端捕蝇草模块(VFT)区域可与鲜味配体结合,识别鲜味。本文主要论述了鲜味受体的研究进展、鲜味识别转导机制及鲜味受体基因的表达调控等,以期为相关研究提供参考。