T6SS阳性CRKP临床感染特征及毒力基因分析

目的分析T6SS阳性耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)临床感染特征,以及其耐药、毒力基因检出率和生物膜形成能力,为临床防控CRKP感染提供参考数据。方法收集2019年1月—2022年12月安徽某三甲医院临床分离的CRKP菌株及患者资料,PCR法检测T6SS基因、毒力基因、耐药基因和分子分型,96孔板结晶紫染色法检测生物膜形成能力。结果共纳入160株CRKP。标本来源以痰(46.9%)和血(26.3%)为主。CRKP菌株呈现多重耐药表型,以携带bla KPC(80.6%)为主,其次为bla NDM(17.5%)。根据是否携带T6SS将CRKP分为T6SS阳性组(129株,80.6%)和T6SS阴性组(31株,19.4%)。T6SS阳性组患者患慢性肺部疾病和心脏疾病比例高于T6SS阴性组(P<0.05),且预后较阴性组差(P<0.05)。T6SS阳性组中,iuc A、mrk D、rmp A2、peg 344、wab G、fim H检出率均高于T6SS阴性组(均P<0.05)。CRKP中以ST11型(68.8%)为主,其中K64-ST11型占比70.9%,K47-ST11型占比25.5%。T6SS阳性组ST11型和K64-ST11型CRKP占比均高于T6SS阴性组(均P<0.05)。T6SS阳性组CRKP生物膜形成能力强于T6SS阴性组(P<0.001)。两组除bla OXA-48基因外,在携带其他碳青霉烯类耐药基因和抗菌药物耐药率方面差异无统计学意义。结论该地区CRKP呈现多重耐药,CRKP菌株T6SS检出率高,T6SS阳性CRKP毒力基因检出率更高,且生物膜形成能力更强。

血流感染肺炎克雷伯菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)的分布及其与毒力和耐药性的相关性分析

目的检测Ⅵ型分泌系统(T6SS)在血流感染分离肺炎克雷伯菌中的分布,并分析其与毒力基因、抗生素耐药之间的关系。方法收集我院血培养分离出的肺炎克雷伯菌,通过PCR方法检测T6SS基因、荚膜血清型和毒力基因,并通过VITEKR2 Compact进行药敏试验。结果56株肺炎克雷伯菌中,26株(46.43%)T6SS阳性。T6SS阳性株中K1、K2荚膜血清型和11个毒力基因的检出率高于T6SS阴性株(P<0.05)。T6SS阳性肺炎克雷伯菌对抗生素更敏感(P<0.05)。HvKP中T6SS阳性率显著高于T6SS阴性率(P<0.05)。从社区和肝脓肿中分离的T6SS阳性肺炎克雷伯菌更多(P<0.05)。糖尿病、携带Aerobactin、rmpA毒力基因是T6SS阳性肺炎克雷伯菌引起血流感染的独立危险因素。结论Ⅵ型分泌系统(T6SS)在引起血流感染的肺炎克雷伯菌中检出率较高,T6SS阳性株携带更多的毒力基因,可能是导致血流感染的主要原因。

铜绿假单胞菌PA14 H3-T6SS的调控功能研究

【目的】研究模式病原细菌铜绿假单胞菌PA14(Pseudomonas aeruginosa PA14)第三套六型分泌系统(H3-T6SS)的调控机制和在环境适应等方面的功能,为该菌致病机制研究和治疗方案开发奠定基础。【方法】以铜绿假单胞菌PA14为研究对象,利用凝胶迁移阻滞试验(EMSA)验证σs因子(RpoS)与H3-T6SS启动子区的结合能力;构建rpoS敲除菌株(ΔrpoS)及回补菌株(rpoS),用启动子酶活试验研究RpoS对H3-T6SS表达的调控作用;构建H3-T6SS关键组分clpV3敲除菌株(ΔclpV3)及回补菌株(clpV3),测定其在酸、渗透压等不同胁迫下的细胞存活率;检测H3-T6SS对铜绿假单胞菌PA14生物膜形成和运动能力的影响。【结果】RpoS蛋白可以直接结合H3-T6SS启动子区;成功构建了铜绿假单胞菌PA14的rpoS和clpV3敲除菌株及回补菌株,RpoS正调控H3-T6SS的表达,H3-T6SS有助于细菌抵抗酸胁迫,但对渗透压胁迫响应不明显;H3-T6SS可显著增强细菌的生物膜形成和运动能力。【结论】铜绿假单胞菌PA14的H3-T6SS受调控因子RpoS的正调控,在增强细菌抗酸胁迫、生物膜形成和运动能力等方面有重要作用。

弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS影响FliC的表达和分泌

目的研究弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛功能。方法构建弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS基因组岛的精确缺失突变株(CF74ΔT6SS)。对弗氏枸橼酸杆菌CF74和其突变株CF74ΔT6SS的全菌蛋白和上清蛋白进行提取,并进行2-DE分析。结果在CF74ΔT6SS全菌蛋白中,有4个蛋白表达上调,42个蛋白表达下调,并且Fli C的表达下调十分明显;在CF74ΔT6SS的培养上清中,有27个蛋白表达上调,36个蛋白表达下调,并且Fli C、Flg K和Fli D的表达下调十分明显。结论弗氏枸橼酸杆菌CF74的T6SS可以影响Fli C蛋白的表达和分泌。

铜绿假单胞菌T6SS的组装、分泌、功能和调控

作为一种对抗真核细胞和原核细胞的强有力细菌武器,VI型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)广泛存在于革兰氏阴性菌中。铜绿假单胞菌是一种对多种抗生素具有耐药性并能够在人体引发急性和慢性感染的条件致病菌,它编码3套独立的T6SS,分别为H1-、H2-和H3-T6SS。T6SS通过介导细菌间竞争、生物被膜的形成、金属离子的摄取以及与真核宿主细胞之间的相互作用,对铜绿假单胞菌在毒力和适应环境方面发挥重要作用。本文主要对铜绿假单胞菌T6SS的组装、效应蛋白的分泌、功能及调控机制展开综述,旨在为T6SS的研究提供一定的参考,并为铜绿假单胞菌感染的预防和治疗提供一定的指导。

脆弱拟杆菌六型分泌系统对肠道屏障的影响及机制

【目的】探讨脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)中六型蛋白分泌系统(T6SS)对肠道屏障的影响及作用机制。【方法】采用自杀载体构建B.fragilis T6SS缺陷株。建立葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的肠炎小鼠模型,并分别补充PBS,B.fragilis WT和B.fragilisΔT6SS,随后比较三组小鼠疾病特征、肠道屏障完整性的差异。利用荧光定量PCR和免疫组化检测小鼠紧密连接蛋白的表达。采用非靶向代谢组学比较各组小鼠肠道差异代谢物。【结果】T6SS缺失不影响B.fragilis的生物活性。与PBS对照组相比,B.fragilis WT明显改善小鼠的体重丢失、结肠长度等疾病指标,表现出对DSS诱导的肠炎的保护性,而B.fragilisΔT6SS随着T6SS的敲除丧失了对DSS诱导的肠炎的保护性。小鼠血清中异硫氰酸荧光素葡聚糖含量和肠道病理切片均表明B.fragilis T6SS能改善小鼠肠道屏障的完整性。荧光定量PCR和免疫组化均表明B.fragilis T6SS影响肠道紧密连接蛋白的表达。非靶向代谢组学分析表明,与B.fragilisΔT6SS组相比,B.fragilis WT组显著上调96个肠道差异代谢产物,其中多个代谢产物富集到胆碱能突触代谢和甘油磷脂代谢相关通路。【结论】拟杆菌T6SS改变肠道代谢组并提高肠道细胞紧密连接蛋白的表达,改善肠道屏障的通透性,参与到拟杆菌对肠道屏障的保护性。

rpoS对鳗弧菌MHK3株Hcp表达和杀菌能力的影响

溶血素共调节蛋白(Hcp)的合成和分泌是六型分泌系统(T6SS)行使功能的重要特征。RNA聚合酶的σ亚基RpoS参与调节细菌的生长和应激反应。为了探究RpoS对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)T6SS的调控作用,本研究构建了 MHK3ΔrpoS突变株,检测了部分表型特征的变化;利用lacZ半乳糖苷酶报告基因检测了突变株hcpl和hcp2在转录水平的变化;进行Western blot并定量分析突变株Hcp在翻译水平的变化;并通过细菌拮抗实验检测了突变株杀菌能力的变化。结果显示,MHK3ΔrpoS突变株的生长情况、泳动性、明胶酶活性及酪蛋白酶活性与MHK3野生株相比无显著差异(P>0.05),而平台早期的菌膜形成能力有显著上升(P<0.05);在各生长时期,MHK3ΔrpoS的hcpl和hcp2在转录水平的表达量均较MHK3有显著上升(P<0.01),最高时分别为MHK3的1.79倍和1.94倍;在翻译水平上,MHK3ΔrpoS在胞内和胞外Hcp的分泌均有显著升高(P<0.05),最高时分别为MHK3的1.59倍和1.31倍;同时,MHK3ΔrpoS对大肠杆菌(Escherichia coli) E5的杀菌能力约为MHK3的1%。研究表明,rpoS对鳗弧菌MHK3株的生长情况、泳动性、明胶酶活性及酪蛋白酶活性均无显著调控作用,但对平台早期的菌膜形成能力具有一定的负调控作用,在转录和翻译水平上也负调控Hcp的表达。而在杀菌能力上,rpoS发挥一定的正调控作用。说明菌株的杀菌能力强弱并非直接与Hcp的表达和分泌量正相关。本研究为进一步阐明T6SS的调控机制及其介导的杀菌作用机制提供了新思路,并丰富了其理论基础。

沙门菌Ⅵ型分泌系统组装、结构特征和分泌调控网络的研究进展

Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system, T6SS)是革兰阴性菌中广泛存在的一种“分泌装置”和“杀伤机器”,其功能是将细菌毒素输送至原核或真核细胞中从而抑制/杀灭它们。T6SS在沙门菌致病过程中发挥着重要作用,能够独立编码5套T6SSs(T6SS-1~T6SS-5),分别由沙门菌毒力岛6(SPI-6)、毒力岛19(SPI-19)、毒力岛20(SPI-20)、毒力岛21(SPI-21)和毒力岛22(SPI-22)编码。T6SS参与沙门菌的种间竞争、生物被膜形成、金属离子摄取运输以及与宿主细胞相互作用,在沙门菌生活周期中发挥不可或缺的作用。本文主要综述沙门菌T6SS组装、基因组结构特征以及分泌调控网络最新研究进展,为深入研究沙门菌致病机制以及开发新的抗菌策略提供理论指导。

一株从草鱼中分离的嗜水气单胞菌的病原学及基因组特征

为确定南昌地区某渔场草鱼出血性败血症的病原体及病原特征,从患病草鱼的肝脏病灶中分离出一株致病菌A1310。对分离菌进行了形态特征、理化特性等表型生物学检验、人工感染实验及对抗菌药物的敏感性实验,并对其进行了全基因组测序、基于多序列位点分型(multilocus sequence typing,MLST)的系统进化分析及毒力基因分析。结果显示,生理生化鉴定证明该菌为嗜水气单胞菌,当浓度达1.0×10~6 CFU/mL时,对草鱼有致病性;对供试20种抗菌药物中的青霉素等7种耐药,对卡那霉素等5种敏感;A1310株基因组框架序列共包含96个与毒力和防御相关基因,其中多药耐药性外排泵基因占大多数,约为22%;与美国斑点叉尾鮰分离株(S15-242、S15-458、S15-591、S15-700)聚类为同一进化分支;比较基因组分析发现,A1310具有一个删减版的Ⅵ型分泌系统(typeⅥsecretion system,T6SS),基因数量为标准Ⅵ型分泌系统的80%,缺少vgr G和vca0109基因的部分片段。综上所述,来源于草鱼的嗜水气单胞菌菌株A1310,与美国斑点叉尾鮰分离株具有亲缘关系,含有多个已报道的嗜水气单胞菌的毒力基因。本研究不仅丰富了嗜水气单胞菌的生物学性状内容,也为嗜水气单胞菌的有效检验、防治和深入研究提供一定的参考,对草鱼的疾病防控具有一定意义。

细菌Ⅵ型分泌系统Hcp与VgrG蛋白的共进化分析

以组成Ⅵ型分泌系统(T6SS)鞘结构蛋白Hcp和VgrG为研究对象,通过蛋白质序列同源性、进化特征及表达相关性的分析,以了解Hcp和VgrG共进化的特征及其在表达上的相互影响。结果表明:Hcp与其他T6SS结构基因共进化,但VgrG却有很大的随机性。1个细菌可能有多套T6SS,一般1个hcp基因对应1套系统。vgrG的数目变化很大,有的细菌只有1个vgrG基因,有的细菌却多达30个,且与有多少套T6SS没有多大的关系。进化分析表明:Hcp可分为14个类,种间的差异小于种内差异。VgrG在进化上可分为3大类,种间差异也小于种内差异。VgrG多样性可能与其识别并辅助不同效应因子转运有关。共进化分析显示VgrG与Hcp具有一定的共进化特性,可推测单个细菌中相互配对的VgrG与Hcp。表达分析显示,在水稻细菌性条斑病菌RS105中,几乎所有的vgrG都与hcp基因的表达正相关,说明在表达水平不能分析两者之间的进化关系,但可说明RS105中VgrG与Hcp功能的相关性。因此,VgrG与Hcp在进化和功能上具有显著相关性。

革兰氏阴性细菌Ⅵ型分泌系统的研究进展

细菌的Ⅵ型分泌系统(T6SS)参与了细菌与细菌间、细菌与宿主间的相互作用,在细菌的存活及致病中发挥着重要的作用。本研究中综述了细菌T6SS的发现与命名、结构与组成,调控机制(Fur、σ54依赖性激活因子、表面缔合、群体感应)与作用机制的最新研究进展,并对其下一步的研究方向进行展望。本研究结果可为深入研究细菌T6SS在细菌间及细菌与宿主间的作用机制,研制基于T6SS的疫苗或靶向药物,寻找对细菌T6SS有效的防控措施提供参考。

细菌Ⅵ型分泌系统结构与调控的研究进展

VI型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)具有转运效应蛋白分子到多种类型靶细胞的能力,广泛存在于革兰氏阴性菌,其结构复杂。当前T6SS结构模型表明其装置至少包含两个复合物:细胞膜跨膜相关装置和动态的噬菌体样结构。本文主要围绕T6SS分泌装置的结构、结构元件相互作用功能以及影响装置表达和活性的条件和信号来进行简要综述。

铜绿假单胞菌中Ⅵ型分泌系统及其参与铁离子转运机制的研究进展

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种分布广泛的机会致病菌,临床上可引起急性或慢性感染。Ⅵ型分泌系统(type Ⅵ secretion system,T6SS)是铜绿假单胞菌中一种重要的分泌系统,不仅能分泌多种毒力蛋白至环境或真核细胞中,还能促进铜绿假单胞菌生物被膜的形成,在铜绿假单胞菌的致病性及耐药性中发挥重要作用。铜绿假单胞菌的T6SS不仅可以转运毒性蛋白,还能够参与金属离子的转运,从而解除自身的环境压力及生存竞争。本文主要针对铜绿假单胞菌中T6SS的结构组成、调控及其对铁离子的转运机制等方面的研究进行综述。

鲍曼不动杆菌Hcp基因原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的获取鲍曼不动杆菌Ⅵ型分泌系统(T6SS)核心组分溶血素共调节蛋白(Hcp)。方法根据ATCC17978菌株Hcp基因序列设计并合成一对含XhoⅠ和NcoⅠ酶切位点的特异性引物,利用PCR方法扩增Hcp基因全长,定向克隆至含His标签的pET-28a(+)载体,采用PCR、双酶切和测序技术验证载体是否构建成功,进而转化Escherichia coli(E.coli)BL21(DE3)菌株,以IPTG诱导表达Hcp蛋白,分析目的蛋白的表达方式及最佳表达条件,通过Western blot鉴定目的蛋白,超滤管浓缩并保存。结果获得了预期500bp左右的Hcp基因,并成功克隆至pET-28a(+)质粒,经IPTG诱导表达,成功纯化出Hcp融合蛋白。结论成功获得鲍曼不动杆菌Hcp基因的原核表达产物,为深入研究T6SS及Hcp奠定了基础。

植物病原细菌Ⅵ型分泌系统研究进展

[目的]Ⅵ型分泌系统(T6SS)作为植物病原细菌发挥重要功能的调控系统之一,主要表现为通过效应子的释放对宿主植物的攻击性和自身在种间竞争过程中面对胁迫反应的防御性等方面,明确重要植物病原细菌的T6SS蛋白及功能差异,有助于推动预防和治疗植物病害的新型农药的开发和利用。[方法]通过对比分析5种重要植物病原细菌(丁香假单胞菌、青枯雷尔氏菌、根癌农杆菌、梨火疫病菌、稻生黄单胞菌)中138个T6SS蛋白的保守结构域以及遗传关系,同时,基于对国内外文献数据库中有关上述5种细菌的T6SS功能研究的文献开展分析。[结果]明确5种植物病原细菌中T6SS蛋白在种类和数量上存在差异性。根据蛋白序列同源性及结构域,上述蛋白分为3大类,其中,含有VgrG、HCP等结构域的T6SS蛋白具有很好的聚类区分度,而含有TssA、TssG等结构域的T6SS蛋白则可分散在不同类别中。[结论]明确5种植物病原细菌中T6SS蛋白及功能具有一定保守性和独特性特征。该研究为进一步开展不同植物病原细菌中T6SS蛋白的预测分析,以及不同T6SS蛋白之间的关系解析提供理论基础。

绿脓杆菌特有的Tsi2三维结构——一种全新卷曲螺旋构象的类抗毒素蛋白

绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)利用六型分泌系统(T6SS)向其他竞争性细菌分泌毒素效应分子Tse2,这是一种新发现的绿脓杆菌获得生存优势的分子机制.为了避免同类间的误杀,绿脓杆菌合成一种特异结合Tse2的抑制蛋白Tsi2来保护自己.序列分析显示,Tsi2是绿脓杆菌特有的一种新型类抗毒素蛋白.我们利用SAD方法成功地解析了Tsi2 1.8魡分辨率的晶体结构.Tsi2的三维结构采用一种规则的卷曲螺旋的结构特征,这是抗毒素分子中的一种全新的折叠方式,不同于经典的抗毒素分子在没有结合毒素分子状态下采用无规则构象的结构特征;二聚体是Tsi2的功能单位,二聚体内两个Tsi2单体通过广阔的疏水相互作用紧密结合,形成"夹子"状独特的二聚体组装方式;位于二聚体界面上的两个凹槽分别结合对称分子的两段螺旋,提供了Tsi2与Tse2结合可能的分子部位.该研究工作结果对于认识Tsi2抗毒素蛋白的分子本质,揭示其发挥抗毒素活性的结构基础,并为进一步开展Tse2-Tsi2复合物的结构与功能研究奠定了坚实的基础.

细菌Ⅵ型分泌系统溶血素共调节蛋白研究进展

Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ secretion system,T6SS)是革兰阴性菌中的一种重要的分泌系统,可参与细菌的致病性,并与生物膜的形成、识别异己和应激反应以及细菌耐药性的获得有关。溶血素共调节蛋白(hemolysin co-regulated protein,Hcp)是T6SS的核心组成部分,构成其内管结构,形成六聚环允许效应物质通过,并可保护效应物质避免其被降解。对Hcp蛋白功能的探讨及阐述T6SS的作用机制至关重要。研究发现,Hcp是一种在不同细菌中具有多样功能的分泌蛋白,如可影响细菌的运动能力、黏附能力、在靶细胞内定植的水平、参与细菌间竞争的能力、在动植物宿主内定殖的能力以及影响细菌的生物膜形成等。现将T6SS的核心组分Hcp的研究进展作一简明的概述,从而为全面认识T6SS的功能并深入探讨其作用机制提供参考依据。

细菌Ⅵ型分泌系统及其致病机制的研究进展

Ⅵ型分泌系统(Type Ⅵ secretion system,T6SS)是新近发现的一种细菌分泌系统,广泛存在于革兰阴性菌中,与细菌的致病性密切相关。目前,多种致病菌T6SS的致病机制都获得了广泛的研究。总结近年来T6SS的相关文献,对霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、沙门菌等致病菌的T6SS及其致病机制作一综述。

利用Red重组系统敲除鲍曼不动杆菌asa A基因

目的利用Red重组系统敲除鲍曼不动杆菌ATCC 17978的asaA。方法设计上下游引物中包含asaA的同源序列,并以pKD4质粒为模板,扩增含有卡那霉素抗性基因的DNA片段。将该片段转化于表达重组酶的17978感受态细胞中,在卡那霉素筛选压力下,得到经两次同源双交换的具有卡那霉素基因标记的突变菌株。随后,在重组酶的作用下将抗性基因去除,最终得到无抗性基因标记的突变菌株ΔasaA。结果通过该重组系统,首先将卡那霉素抗性基因的DNA片段替换了基因组中asaA的DNA片段,然后将卡那霉素抗性基因的DNA片段消除,最终获得了asaA缺失的突变体。结论通过Red重组系统为鲍曼不动杆菌中其他基因的缺失突变提供方法与思路。

鲍曼不动杆菌VI型分泌系统研究进展

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,AB)是一种临床常见的不动杆菌,属革兰阴性非发酵菌,其多重耐药性严重降低了治疗选择性,对全球的医疗系统造成极大威胁。VI型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)是革兰阴性细菌中广泛存在的毒力系统,可通过直接接触将效应因子注入临近细菌导致其死亡,实现自我保护。T6SS在AB中高度保守,越来越多的证据表明,T6SS在AB感染致病过程中发挥着重要作用。现对AB T6SS的组成、功能、调控等方面的研究进展作一综述,为深入研究AB的致病及耐药机制提供依据,并为其防控提供参考。