TAIL-PCR方法快速克隆银杏查尔酮合成酶基因及序列分析(英文)

热不对称交错PCR(TAIL-PCR)方法已广泛应用于从多种生物克隆已知DNA序列的侧翼序列。对传统的TAIL-PCR方法进行改良:(1)将TAIL技术应用于TAIL-PCR中第3步PCR循环。(2)以10bp的随机简并引物即RAPD引物代替基因侧翼简并引物。以银杏品种家佛手的叶基因组DNA为模板,利用简并引物克隆到银杏查尔酮合成酶基因(CHS)片段序列Gbchs1,以此序列设计3条特异引物,利用改良的热不对称交错PCR方法克隆到CHS基因Gbchs2。结果表明,Gbchs2长1238bp,编码304个氨基酸并包含3’末端序列。GbCHS2蛋白质序列与其他植物的CHS蛋白质序列高度同源,包含CHS蛋白质保守的环化作用活性位点,催化活性位点、香豆素活性位点、及催化活性基序。改良后的TAIL-PCR方法为基因全长的克隆提供了一种简单快速高效的新方法。

TAIL-PCR的改良及其在分离小麦基因启动子中的应用

在经典TAIL-PCR(Thermal asymmetric interlaced PCR)的基础上,对其进行了如下四处改进:用10个碱基的RAPD引物代替16个碱基的随机兼并引物作为PCR中的随机引物;将较低特异性循环的复性温度由44℃降至29℃;增加5个高特异性反应循环,减少5个较低特异性反应循环;用单引物对第三轮PCR产物进行初步鉴定。利用改进的TAIL-PCR方法分离了小麦X基因的5′未知的侧翼序列,与GUS基因融合后转入拟南芥,通过组织化学检测分析表明分离到的5′侧翼序列具有启动子功能,同时说明改进的TAIL-PCR能更好地应用到较复杂基因启动子的分离。

TAIL-PCR方法快速分离Xcc致病相关基因序列

以mini Tn5gfp km转座子中nptII片段作为探针 ,对已获得的五株野油菜黄单胞菌野油菜黑腐病致病型(Xcc)非致病突变体进行了Southernblot分析 ,结果表明 ,这五株突变体确由mini Tn5gfp km转座子插入致病相关基因所致 ,且为单拷贝不同位点的插入。提取这五株突变体总DNA作为模板 ,采用改进的热不对称交错PCR (TAIL PCR)方法从其中克隆到了各自转座子插入区侧翼序列 ,对这些侧翼序列进行了序列测定并将分析结果与GenBankdatabase及Xcc全基因组序列做了比较 ,结果表明 ,五个侧翼序列所在的基因确与Xcc致病性有关。这种改进后的TAIL

TAIL-PCR法快速分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点侧翼序列

采用热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)法分离红曲霉色素突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增到了长度介于500bp～1300bp之间的7个DNA片段,对这些DNA片段测序,并采用生物信息学方法对测序结果进行了分析,表明其中有1个片段与烟曲霉Af293发育调控子flbA的相似性较高。TAIL-PCR法成功应用于分离红曲霉突变株T-DNA插入位点的侧翼序列,为大规模获取插入位点侧翼序列建立了可行的方法,也为进一步研究红曲霉功能基因奠定了基础。

优化TAIL-PCR方法克隆棉花抗逆相关转录因子编码基因

ABF/AREB/ABI5/DPBF类转录因子属于碱性亮氨酸类蛋白,在依赖ABA的逆境信号传导途径中起重要的作用。本研究结合该类转录因子的结构特点,利用3′RACE技术和优化的TAIL-PCR技术成功获得棉花中三个该家族成员编码基因。进一步验证结果表明两步PCR成功获得基因完整的ORF、3′UTR以及部分5′UTR序列。本研究所获基因为棉花抗逆基因工程提供了候选基因源,优化后的TAIL-PCR技术为克隆棉花中目的基因提供了一种简便高效的方法。

一种DNA侧翼序列分离技术——TAIL-PCR

在分子生物学研究中,基因克隆和分子杂交的探针制备等操作常需分离与已知DNA序列邻近的未知序列,热不对称交错PCR(简称TAIL PCR)反应技术能够较好地解决上述难题。该技术通过3个嵌套的特异性引物分别和简并引物组合进行连续的PCR循环,利用不同的退火温度选择性地扩增目标片段,所获得的片段可以直接用做探针标记和测序模板。TAIL PCR技术简单易行,反应高效灵敏,产物的特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经成为分子生物学研究中的一种实用技术。笔者综述了TAIL PCR反应的原理、引物设计、反应条件设置及产物分析。

改良TAIL-PCR技术在小麦PM H^＋ -ATPase基因启动子克隆中的应用

以小麦基因组DNA为模板,利用改良的热不对称交织PCR(TAIL-PCR)技术成功克隆到小麦PM H+-AT-Pase基因的上游侧翼序列,测序结果表明,该序列全长363 bp.序列分析结果表明,GGGCGGG序列位于-141^-135 bp;TATA-box位于基因转录起始位点CAT-box上游-37^-32 bp;-70^-80 bp间没有发现CCAAT-box;ATG位于CAT-box下游203~205 bp处,5’UTR(非编码区)序列全长202 bp,表明该序列为小麦H+-ATPase启动子序列.

利用TAIL-PCR和RT-PCR技术克隆云芝植酸酶基因

从采绒革盖菌(Coriolus versicolor,常被称为杂色云芝)中筛选到产植酸酶基因.根据植酸酶基因的保守序列设计引物P1、P2,从云芝中分离克隆植酸酶基因的片段.再在分离到的已知序列的5′端和3′端设计嵌套的特异引物SP1、SP2、SP3和SP1′、SP2′、SP3′,利用TAIL-PCR技术进行分离已知序列的侧翼序列.结合Blastn、ORF和Primer5.0软件,在侧翼序列上设计特异引物P3、P4,最终从云芝中分离克隆到全长的植酸酶基因B4.再在B4序列的基础上设计引物phyP rt1、phyP rt2,利用这两个引物通过RT-PCR技术从云芝中克隆到全长的植酸酶基因B5.通过分析,分离克隆到的植酸酶基因可能是新的基因.

高效、新T-DNA侧翼序列分离技术--Actail-PCR

【目的】建立一种有效分离T-DNA插入突变体侧翼基因组序列的方法。【方法】分离侧翼的目标基因组序列是利用T-DNA标签法研究植物功能基因组学的一个关键步骤,笔者发展稳定高效的Actail-PCR分离技术。该技术一侧引物来自于T-DNA载体,另一侧引物为一个复性控制引物。复性控制引物在3'端为一个14bp的随机简并引物,在5'端非目标尾部序列接上一个通用引物,中间由5个多聚脱氧次黄嘌呤核苷(poly(dI))连接。【结果】Actail-PCR技术将随机简并引物重新编辑成复性控制引物,在40℃的低严谨条件下,3'端的随机简并引物可以与T-DNA插入突变体的侧翼目标区段随机的结合,扩增得到目标片段,随后利用5'端的通用引物与T-DNA载体上的巢式引物依次组合,在65℃(10个循环后逐步降温至58℃)的高严谨条件下逐步扩增特异片段,同时抑制非特异性扩增,可以显著提高目标片段的扩增效率,减少假阳性。【结论】相对传统的TAIL-PCR,Actail-PCR技术可以更高效地分离T-DNA插入突变体的侧翼基因组序列。

不同TAIL-PCR通用引物在转基因大豆、水稻、油菜侧翼序列分离中的应用评价

为研究不同转基因作物T-DNA插入位点侧翼序列分离中所用的通用简并引物对TAIL-PCR的影响,本研究使用5个通用简并引物分别对8个转基因大豆、30个转基因水稻和2个转基因油菜株系进行了TAIL-PCR分析,结果表明,5个简并引物在TAIL-PCR中的扩增效果存在显著差异,同一简并引物在不同转基因物种的扩增效果显著不同。AD1引物在转基因水稻和转基因油菜中扩增效果较好,AD2引物在转基因水稻、油菜和转基因大豆中扩增效果均较好,AD3引物在转基因水稻中扩增出1个株系,在转基因油菜中扩增出1个株系,但AD3引物与pFGC5941 T-DNA RB上游有匹配,不适用于以pFGC5941为载体的转基因材料分析。AD4和AD5 2个引物在3个转基因物种的扩增均较差。对AD1和AD2两个引物的TAIL-PCR扩增产物进行测序,结果表明,扩增产物均对应转基因材料的侧翼序列。研究表明,不同通用引物在不同转基因事件中侧翼序列的分离效果差异较大,通用引物AD1和AD2TAIL-PCR成功率最高。不同通用引物的应用效果不仅与不同物种有关,也与外源基因的插入位点有关,而且还与载体序列匹配程度相关。为提高TAIL-PCR中T-DNA插入位点侧翼序列分离成功率,建议同时采用多个通用引物平行扩增。

应用Tail-PCR扩增蓝猪耳T-DNA侧翼序列

蓝猪耳是一种重要的具有观赏和科研价值的花卉植物.采用TAIL-PCR成功扩增了转基因蓝猪耳T-DNA插入位点的侧翼序列,扩增片断长度为200～2000bp,大多数片段在400bp和800bp左右,其中36%的序列含有植物的同源序列.通过与GenBank数据库比对,确定了部分T-DNA插入位点周边序列编码的可能蛋白,并提交序列7条;另外还对T-DNA转化植物时整合的位点进行了分析,发现断裂位点集中在距右边界15～18bp和右边界外234bp处,分别占总扩增片段的47.62%和38.10%.这为利用T-DNA标签进行蓝猪耳基因克隆和功能分析提供了实验技术上的保证.

青稞B组醇溶蛋白基因5′上游调控区的TAIL-PCR克隆及序列分析

为了阐明青稞种子中B组醇溶蛋白合成的遗传调控机制，为分子改良大麦和小麦籽粒品质奠定基础，以青稞品种Z09和Z26的基因组DNA为模板，根据已克隆的青稞B组醇溶蛋白（B-hordein）基因的5’端序列设计三个基因特异的反向引物，分别与随机简并引物配对，进行热不对称嵌套PCR（Thermal asymmetric interlaeed PCR，TAIL-PCR）扩增，从两份西藏青稞材料中分离克隆出2个B-hordein基因的上游调控序列。序列测定结果表明，两个扩增片段长度分别为395和396bp，加上已知B-hordein基因中的GSP2引物序列与翻译起始密码子之间198bp的长度，则可得到约600bp的B-hordein基因5’上游调控序列。将所得序列与Genbank中的三个贮藏蛋白基因的对应区段进行序列比对，所得序列与来自野生智利大麦（H．chil-ense）的B3-hordein基因（Genbank登录号：AY998010）、普通小麦（T.aestivum）的低分子量麦谷蛋白亚基基因（Genbank登录号：X07747）和栽培大麦（H．vulgare）的B-hordein基因（Genbank登录号：X03103）具有81％～95％的序列相似性。推测其TATAbox位于-80bp，CAAT-likebox位于-140bp处。另外，在-300bp处存在一个胚乳盒（EndospermBox，EB），包含EM基序和GCN4基序。EM基序高度保守，GCN4基序有一个核苷酸位点的突变。此外，在约-560bp处存在一个胚乳盒类似结构。

斜卧青霉114-2 cbh1基因的TAIL-PCR克隆及与抗阻遏突变株JU-A10的比较

【目的】研究斜卧青霉(Penicillium decumbens)114-2与其抗阻遏突变株JU-A10外切酶基因序列的差异。【方法】用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和RT-PCR扩增得到斜卧青霉114-2外切葡聚糖酶Ⅰ(cbh1)基因全长和cDNA全长。【结果】cbh1基因全长为1500bp,含有两个内含子,编码453个氨基酸(GenBank,EF397602)。克隆并分析了1.9kb的cbh1基因上游序列,分别发现了葡萄糖代谢抑制因子CREⅠ与纤维素酶转录调控蛋白ACEΙ的两个的潜在结合位点。【结论】在相同的培养条件下,其抗阻遏突变株JU-A10的外切酶活明显高于野生株114-2。两菌株的cbh1基因序列完全一致,说明外切酶活明显提高不是由于cbh1基因发生突变引起的。

利用TAIL-PCR技术克隆猴头菇β-glucosidase基因

根据已知的β-glucosidase基因的保守序列设计引物,从猴头菇的菌丝体中克隆到β-glucosidase基因片段B1,再利用TAIL-PCR技术扩增B1两端的侧翼序列B2和B3,B2和B3序列经Blastn、ORF和Primer5·0软件分析后,再设计B2和B3侧翼序列的特异引物对猴头菇的基因组DNA进行扩增,最终扩增到全长的β-glucosidase基因,其大小为2226bp。

梅花南京红须F3′H全长基于gDNA的TAIL-PCR法克隆(英文)

根据从基因组DNA扩增到的梅花‘南京红须’类黄酮3'-羟化酶基因片段(469 bp)没计3条嵌套的特异性引物，与6条短的随机简并引物组成的引物库分别用热不对称交错PCR法从‘南京红须’基因组DNA扩增该片段的5'和3'旁侧序列。获得的5'和3'旁侧序列分别长1443 bp和1200 bp。将两个旁侧序列在469 bp片段的基础上拼接得到‘南京红须’全长为2 144 bp的类黄酮3'-羟化酶基因，被命名为pmhxF3'H。序列分析表明：该基因与11条正式发表的、已递交到GenBank的类黄酮3'-羟化酶基因的cDNA序列在总体上有52．21％的一致性．具有3个内含子，其启动子含有1个“AGGA盒”、1个“GC盒”和3个“TATA盒”。这是首次用热不对称交错PCR法从木本植物的基因组DNA克隆到类黄酮3'-羟化酶基因。本研究将为梅花花色的分子生物学机理探索、花色的基因工程改良提供参考。

TAIL-PCR的技术改良及对香蕉NBS-RGC5基因侧翼序列的克隆

香蕉枯萎病是一种毁灭性真菌病害,对香蕉的种植和产业发展危害严重,研究香蕉枯萎病相关的抗性基因,具有重要的理论意义。对TAIL-PCR进行技术改良,以简并引物组合的方式与特异性引物进行扩增,代替最初的单一简并引物方式,在TAIL-PCR第一轮扩增的大循环中设置不同的退火温度;采用改良后的TAIL-PCR成功克隆了巴西蕉NBS型抗性蛋白(NBS-RGC5)基因的侧翼序列。

利用TAIL-PCR克隆耐盐基因及其分析

通过大量筛选得到一株高耐盐的豇豆根瘤菌WME7,最高可耐15g/L NaCl,利用Tn5-sacB转座子对该菌株进行随机插入突变,从突变子中筛选获得30个共生缺陷型突变株。利用TAIL-PCR(thermal asymmetric interlaced PCR)方法克隆了突变株Tn5-sacB侧翼序列,通过BLAST发现有1个突变株的插入失活基因与鼠伤寒沙门氏菌抗银的结合蛋白SilE有94%同源性,表明有关Na+离子的抗性基因可能与Ag+离子的抗性基因有某种关系。该基因在其它菌中也能抗其它金属离子(铜、锌、钴、铬)。

利用TAIL-PCR方法克隆拟南芥干旱主效基因NCED3

利用远红外成像技术筛选得到一株T-DNA插入的干旱敏感突变体,并成功利用TAIL-PCR技术克隆到该突变基因为NCED3,该基因编码植物体内ABA合成的关键限速酶,突变体在干旱胁迫下不能合成ABA而表现出不耐干旱的特性.最后通过PCR及RT-PCR方法验证了TAIL-PCR结果的可靠性.

TAIL-PCR方法克隆约氏黄杆菌aroA基因序列

[目的]研究草鱼烂鳃病病原约氏黄杆菌芳香氨基酸代谢途径的合成基因aroA的全序列。[方法]以草鱼烂鳃病病原M165菌株基因组DNA为模板,分别利用5′和3′的3个特异性巢式引物与随机引物,通过热不对称交错PCR(TAIL-PCR)扩增菌株M165的aroA基因序列,并对其序列进行分析。[结果]电泳检测结果表明,扩增产物与预期扩增结果相符;测序结果分析表明,aroA基因序列全长1 230bp,编码410个氨基酸。aroA蛋白序列与Flavobacterium johnsoniae的aroA蛋白质序列具有高度同源性。[结论]TAIL-PCR方法为基因全序列的克隆提供了一种简便、高效的方法。aroA基因全序列的获得为进一步阐明aroA等营养相关因子对鱼类烂鳃病病原的致病力的影响奠定基础。

应用改良TAIL-PCR克隆黄瓜6PGDH基因上游序列

运用改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)对黄瓜6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因(6-phosphogluconate dehydrogenasegene,6PGDH)的上游序列进行了克隆。与最初的TAIL-PCR相比较,主要改进之处有:(1)根据Primer 5.0软件计算结果从随机RAPD引物库中筛选出合适的上游引物,低严谨和高严谨反应中的退火温度也分别进行了调整;(2)将热不对称交替反应继续应用到第3轮PCR扩增反应中以提高特异目的条带和减少非目的条带。经过3轮PCR扩增反应最终获得位于黄瓜6PGDH起始密码子ATG上游长度为517 bp新序列。试验结果表明,应用改良TAIL-PCR能快速、有效地克隆与已知区域相邻的序列。