草鱼TAB2与TAK1蛋白互作鉴定及其对两种抗菌肽基因表达的影响

为了探究草鱼TAB2(Ci TAB2)与Ci TAK1能否互作及其对2种草鱼抗菌肽基因(Cihepcidin与Ciβ-defensin1)表达的影响,实验首先采用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析拟态弧菌感染后Citab2和Citak1在草鱼免疫相关组织中的时空表达模式。然后利用荧光共定位、免疫共沉淀及Western blot技术鉴定Ci TAB2与Ci TAK1在细胞内共定位及相互作用情况。最后将过表达质粒pEGFP-N1-Citak1与pEGFP-N1-Citab2共同转染草鱼肾细胞(CIK细胞),检测Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平。结果显示,拟态弧菌感染能够显著改变Citab2和Citak1的相对表达水平,前者于感染后不同时间在各检测组织中表现出不同的时空表达模式,而后者均呈现先上调后下调的表达模式;荧光显微镜下观察到Ci TAB2与Ci TAK1共定位于转染后的HEK293T和CIK细胞的胞质中,且在HEK293T细胞内能够形成Ci TAB2-Ci TAK1蛋白复合物;共同过表达Ci TAB2与Ci TAK1后,CIK细胞内Cihepcidin与Ciβ-defensin1的相对mRNA表达水平在各检测时间点均显著上调。结果表明,Ci TAB2与Ci TAK1存在互作关系且二者互作能够促进上述两种抗菌肽的转录表达。本研究从蛋白互作调控抗菌肽表达的角度为防治鱼类弧菌病提供了新策略。

牛源TAK1基因慢病毒载体构建及其在MDBK细胞中的表达

为了探究转化生长因子-β激活蛋白1(TAK1)在牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染中的作用,构建牛源TAK1基因慢病毒载体,筛选TAK1基因稳转过表达细胞株。根据GenBank中牛源TAK1基因序列(登录号:NM-001081595.1)设计引物,PCR扩增目的片段后插入载体中,构建pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒,将其导入293T细胞进行慢病毒包装及滴度测定。用包装好的慢病毒感染牛肾上皮细胞(MDBK),筛选过表达TAK1基因的稳转细胞株,通过荧光显微镜和免疫印迹试验(Western blot)进一步验证该基因的过表达。重组质粒双酶切与测序结果表明成功建立了pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒。慢病毒滴度测定结果显示,过表达TAK1基因组病毒滴度为1.0×108 TU/mL,空载体对照组病毒滴度为5.0×108 TU/mL。重组慢病毒以MOI 180转染MDBK细胞,荧光显微镜观察到明显的红色荧光,表明慢病毒质粒转染成功。Western blot结果显示,在相应分子量处检测到目的条带,进一步表明TAK1基因被表达。成功构建了pCDH-CMV-TAK1-MCS-EF1-turboRFP-T2A-Puro慢病毒质粒,并筛选出了过表达TAK1基因的MDBK稳转细胞株,为深入研究TAK1在BHV-1感染中机制的研究奠定基础。

转化生长因子β激活酶1在食管癌中的表达及其临床意义

目的:探讨转化生长因子β激活酶1(TAK1)在人食管癌组织中的表达及临床意义。方法:收集2002年9月至2008年2月在我院接受手术治疗的食管癌患者80例,所有患者术后经病理结果证实,通过免疫组织化学方法检测TAK1蛋白在食管癌及其癌旁组织中的表达,并探讨TAK1表达量与临床病理特征及患者预后的相关性。结果:TAK1在食管癌组织中阳性表达率为80%,明显高于癌旁正常组织中的阳性表达率11.25%;TAK1的阳性率与食管癌患者的年龄、性别、分化程度及肿瘤大小无关(P>0.05),而与临床分期和淋巴结转移呈正相关性(P<0.05)。此外,研究还发现TAK1的表达量与患者的5年生存率呈反比,高表达TAK1的患者5年生存率显著低于低表达的患者(P=0.008 5)。结论:TAK1可能是食管癌发病机制中的重要参与者,靶向TAK1的治疗有可能改善食管癌患者的预后。

光照与温度对拟南芥tak基因表达与LHC磷酸化的影响

TAK1和TAK2是拟南芥核基因编码的蛋白激酶,TAK1可能参与植物状态转换中LHCⅡ蛋白磷酸化的调控.根据TAK1蛋白序列,合成了一段含12个氨基酸残基的亲水短肽,与牛血清白蛋白(BSA)偶联并免疫家兔得到TAK1抗体.经免疫双扩散和蛋白质印迹检测,该多肽抗体效价和特异性较高.借助TAK1抗体以及磷酸化抗体进行杂交试验,结合特异引物进行半定量PCR,研究了光照与温度对拟南芥tak1和tak2基因表达的影响.结果表明,光强与温度调节LHCⅡ蛋白磷酸化,也会在转录水平和蛋白质水平上影响tak1和tak2基因表达.LHCⅡ蛋白磷酸化对光响应趋势与TAK1蛋白水平变化相同.此外,低光照促进tak2基因表达,tak2基因转录表达受温度的影响较小.tak1和tak2基因表达调控方式不同,可能与启动子响应元件的不同相关.

泼尼松龙可抑制转化生长因子β激活激酶1诱导的成骨细胞凋亡

背景:研究显示转化生长因子β激活激酶1(transforming growth factor beta activated kinase 1,TAK1)在骨、关节的发育以及骨形态信号转导中发挥着重要作用,与骨关节炎的发生也存在一定的相关性。目的:探究泼尼松龙通过抑制TAK1表达对诱导成骨细胞凋亡的影响。方法:将M3T3-E1成骨细胞经原代培养后传代培养。取第3代细胞分为3组,正常细胞组(对照组)、阴性转染+泼尼松龙组、TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组。采用碱性磷酸酶染色和钙结节染色评估成骨细胞分化能力的变化;采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞内磷酸化(p)-TAK1、TAK1、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)、JNK蛋白表达,MTT法检测M3T3-E1细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞周期以及细胞凋亡变化。结果与结论:①TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组细胞的碱性磷酸酶红染程度较少,阴性转染+泼尼松龙组次之,正常细胞组碱性磷酸酶染色最多;钙结节染色显示与正常细胞组相比,阴性转染+泼尼松龙组钙结节数量明显减少,TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组结节数量最少;②荧光显微镜显示,阴性转染+泼尼松龙组细胞出现破碎,形态发生改变,TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组破碎细胞数量明显增加;③Western Blot显示,3组间p-TAK1、p-JNK蛋白表达量逐渐降低(P<0.05);④MTT检测显示,3组间TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组细胞增殖抑制率最高(P<0.05);在12-48h随着时间的延长,细胞增殖抑制率呈逐渐上升趋势,在72h时开始下降;⑤流式细胞仪检测结果显示,TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组G2期细胞比例高于其他2组,S期细胞比例显著低于其他2组(P<0.05);⑥TAK1 siRNA转染+泼尼松龙组细胞凋亡率明显高于正常细胞组、阴性转染+泼尼松龙组(P<0.05);⑦结果说明,沉默TAK1表达后能够增强泼尼松龙诱导成骨细胞凋亡的作用,可能与JNK信号通路相关。

银杏叶提取物对TGF-β1诱导增殖的SD乳鼠心肌成纤维细胞生长抑制作用及其机制

目的观察银杏叶提取物(GBE)对TGF-β1诱导增殖的SD乳鼠心肌成纤维细胞(CFb)生长抑制作用,并探讨其机制。方法取出生1~3 d的SD乳鼠CFb分为4组,其中TGF-β1组加入20 ng/mL的TGF-β1溶液,低浓度GBE组加入20 ng/mL的TGF-β1溶液和2μg/mL的GBE溶液,高浓度GBE组加入20 ng/mL的TGF-β1溶液和20μg/mL的GBE溶液,对照组加入等量含10%胎牛血清的DMEM。取各组细胞,继续培养48 h,采用MTT比色法测算各组细胞增殖率,采用荧光定量PCR法检测各组细胞结缔组织生长因子(CTGF)、氨基末端激酶(JNK)、P38 mRNA。结果TGF-β1组、低浓度GBE组、高浓度GBE组、对照组细胞增殖率分别为124.1%±13.4%、106.1%±7.5%、83.5%±5.2%、100.0%,其中TGF-β1组与对照组、高浓度GBE组相比,P均<0.05。TGF-β1组细胞CTGF、JNK、P38 mRNA相对表达量均高于对照组(P均<0.05),高浓度GBE组细胞CTGF、JNK、P38 mRNA相对表达量均低于对照组和TGF-β1组(P均<0.05)。结论高浓度GBE(20 ng/mL)对TGF-β1诱导增殖的SD乳鼠CFb有生长抑制作用,其机制可能与下调TGF-β1-samd/TAK1信号通路中CTGF、JNK、P38基因表达有关。

人TAK1基因启动子活性的研究

目的鉴定人TAK1启动子片段结构,探索调控TAK1基因高水平转录的启动片段。方法利用生物信息学软件分析TAK1基因启动子结构,构建TAK1启动子序列系列截短的萤光素酶报告基因重组体,脂质体法转染滑膜成纤维样细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS),应用双荧光素酶活性检测系统检测启动子的活性。结果人TAK1基因-260^+25 bp片段具有高转录活性,明显高于其他片段,而-88^+25 bp启动子片段活性最低。结论人TAK1基因-260^-170 bp是主要的转录调控区,是进一步研究DNA结合蛋白的调控靶序列。

急性髓系白血病患者TAK1、p38基因表达及其临床意义

目的了解不同亚型急性髓系白血病（AML）患者TAK1、p38基因的表达差异，并分析TAK1、p38基因不同表达水平患者的临床特征。方法以GAPDH为内参，14名健康人为对照组，采用实时定量聚合酶链反应方法检测87例AML患者骨髓TAK1、p38基因的表达，对结果进行统计学分析。结果AML患者TAK1、p38基因表达均高于对照组（相对表达量：0．194±0．125比0．015±0．008，0．233±0．140比0．010．±0．005，均P〈0．001）。M4患者TAKImRNA表达高于M2、M3、M5（P=0．005、0．000、0．002），M2高于M3（P=0．022）；M4患者p38mRNA表达高于Ml、M2、M3、M5（P=0．013、0．035、0．000、0．045），M2高于M，（P=0．001），M，高于M，（P=0．012）。TAK1高表达组CD56阳性率、外周血白细胞数均高于TAK1低表达组，p38低表达组CDl9阳性率高于p38高表达组，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论AML患者TAK1、1338基因表达升高，其表达上调可能在AML发病中起重要作用。

沉默TAKl表达对三氧化二砷诱导Kasum-1细胞凋亡的影响

目的利用RNA干扰技术研究沉默转化生长因子13激活激酶（TAKl）对三氧化二砷（As2O3）诱导的急性髓系白血病（AML）细胞增殖和凋亡的影响。方法以伴t（8；21）的AML细胞株Kasumi-1为对象，用CCK-8法检测As203对Kasumi-1细胞的增殖抑制作用；Westernblot方法检测As：0，作用不同时间后Kasumi-1细胞磷酸化c—JunN端激酶（P—JNK）的表达；以TAKl特异的siRNA转染Kasumi-1细胞后用As：0，处理细胞作为实验组，同时设立对照组，检测P—JNK表达水平，比较不同处理条件下细胞凋亡率、集落形成率。结果不同浓度As，0，作用于Kasumi-1细胞后，细胞增殖抑制率呈浓度依赖性增高，半数抑制浓度为3．5μmol／L；As，O，作用Kasumi-1细胞不同时间后，P—JNK表达均明显增强，以30min最强；未作任何处理的Kasumi-1细胞、TAKl特异siRNA单纯转染的Kasumi-1细胞、As：O，单独处理的Kasumi—l细胞、TAKlsiRNA转染联合As：0，处理的Kasumi-1细胞凋亡率分别为（5．02-4-1．13）％、（6．18±0．28）％、（48．33±2．70）％、（86．07±2．21）％，集落形成率分别为（73．83±2．78）％、（76．03±1．46）％、（55．07±1．50）％、（22．20±1。15）％，单纯TAKlsiRNA转染组细胞凋亡率与Kasunfi-1细胞未处理组比较差异无统计学意义（P=0．052），其余各组凋亡率比较差异有统计学意义（P=0．000）；单纯TAKlsiRNA转染的Kasumi-1细胞集落形成率与未处理组比较差异无统计学意义（P=0．179），但与其余各组集落形成率比较差异有统计学意义（P=0．000）。结论沉默TAKl基因表达可增强As：0，对Kasumi-1细胞增殖抑制及诱导凋亡作用，其机制可能通过TAKI下游传导信号JNK途径。