类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因组定点修饰技术

人工构建的序列特异性核酸内切酶能够识别并切割特定的DNA靶序列,造成双链断裂,从而引起基因组结构的定点改变。人工核酸内切酶技术使得研究人员有可能对任意物种的基因组进行定点修饰,开启了反向遗传学研究的新天地。类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)自2010年底开始成功应用于基因打靶,很快成为一种比锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)更容易设计、特异性更高和毒性更低的人工核酸内切酶。文章综述了TALEN技术的研究进展及应用前景,重点介绍TALEN的结构、作用机制与构建方法和利用TALEN进行基因组定点修饰的策略,以及目前利用这一技术已成功实现突变的物种及内源基因,特别是在斑马鱼中的应用,为开展这一领域的研究工作提供参考。

利用TALEN技术在牛胎儿成纤维细胞中敲除Myostatin基因

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因能够负向调节骨骼肌的生长和发育,牛MSTN基因突变会出现"双肌"特征。文章利用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)靶向敲除牛胎儿成纤维细胞的MSTN基因,获得敲除MSTN基因的细胞系,为制备MSTN基因敲除牛提供材料。构建一对MSTN基因的TALENs真核表达载体,分别采用PEI转染试剂和电穿孔法进行牛胎儿成纤维细胞的转染,测序结果表明TALEN技术可用于敲除牛MSTN基因,利用T7核酸内切酶1(T7E1)检测其突变效率,结果显示电穿孔转染的敲除效率为20.4%。通过有限稀释法,共获得10个MSTN基因敲除的细胞克隆(包括MSTN-/-和MSTN+/-),其靶位点敲除的碱基数分别是1～20不等,部分会出现移码突变。出现移码突变的细胞系可用于MSTN基因敲除的转基因肉牛的制备。

TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程

类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)是最近发展起来的一类新型的人工核酸内切酶,它由特异性的TALE DNA结合结构域和非特异性的FokⅠ核酸内切酶切割结构域组成。TALEN能够根据用户需要切割特定的核苷酸靶序列,造成DNA双链断裂,从而诱导该靶序列产生indel突变,目前已成功地应用于多个物种或体外培养细胞的基因组定点突变。文章介绍TALEN靶点的选择与确认,采用"单元组装法"构建人工TALEN的原理与步骤,以及通过显微注射TALEN mRNA诱导并筛选斑马鱼突变体的实验流程与经验。这些方法理论上也适用于对其他物种进行基因打靶。

应用TALEN技术对兔CCR5基因进行靶向修饰

缺少合适的能够被人免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus 1,HIV-1）感染的动物模型是获得性免疫缺陷综合征/艾滋病（Acquired immunedeficiency syndrome,AIDS）疫苗和药物研发的瓶颈.HIV-1能在野生型兔子中形成持续感染,在共表达人CD4和CCR5的兔细胞系中,HIV-1能高效复制,并形成合胞体.若在家兔中高表达人CD4和CCR5,就可能获得研究AIDS的理想动物模型.文章采用高效基因打靶技术—类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN）,探讨在家兔CCR5基因位点定点敲入人CD4和CCR5,获得能够感染HIV-1家兔模型的可能性.针对家兔CCR5基因,设计了两对TALENs和一个同源打靶载体,TALEN mRNAs和DNA同源片段显微注射到家兔受精卵中,体外培养3～5 d后,收集24枚胚胎,对胚胎的基因突变情况进行PCR和测序分析.结果显示,在家兔CCR5位点,24枚胚胎均发生了基因敲除,5枚胚胎还发生了人CD4和CCR5基因敲入.该结果为建立艾滋病研究新动物模型奠定了基础.

TALEN介导的MYH9基因沉默及对细胞周期与凋亡的影响

目的利用TALEN技术敲除人胃癌细胞系MGC803细胞株MYH9基因,观察MYH9基因沉默后细胞周期及凋亡改变。方法根据斯丹赛Fast TALETMTALEN试剂盒说明书,设计并构建靶向MYH9基因的TALEN质粒对。通过质粒转染、DNA测序、RT-PCR和Western blot等检测质粒活性,成功挑取MYH9基因敲低单克隆株,并对构建好的细胞株进行周期和凋亡检测。结果成功挑选的MGC803单克隆细胞株未检测到MYH9基因完全敲除;MYH9基因敲低后,MGC803细胞周期受阻于G2/M期(P<0.05),早期凋亡增加(P<0.05)。结论利用TALEN技术成功构建MGC803细胞MYH9基因敲低单克隆株,该模型有助于后期深入探讨胃癌MYH9基因功能。

SD大鼠超排及TALEN质粒显微注射构建基因敲除大鼠

目的 应用TALEN技术构建基因敲除大鼠,并探讨SD大鼠超数排卵、显微注射浓度、胚胎移植方式对构建大鼠出生率、阳性率的影响.方法 将SD雌鼠超数排卵后,取受精卵显微注射由TALEN质粒体外转录成的mRNA,注射后存活的受精卵输卵管移植,观察大鼠的出生率,并测序判定出生大鼠的基因敲除阳性率.结果 4～5周和5～6周的雌鼠超数排卵见栓率[（74±9）％vs（77±6％）％]、取卵数量[（25±2）枚vs （23±2）枚]以及卵的受精率[（85±2）％vs（93±2）％]差异均无统计学意义（P＞0.05）;结扎公鼠和受体雌鼠在8～10周时见栓率最高[（23.02±5.26％）％],使用12周后见栓率明显下降[（11.66±2.40）％];单侧和双侧输卵管移植大鼠出生率差异无统计学意义（37.88％ vs 36.49％）,但单侧移植大鼠存活率高于双侧移植（37.88％ vs 20.27％,P＜0.05）,且单细胞移植大鼠出生率显著高于双细胞移植.质粒注射浓度在20 ng/μl组大鼠基因敲除阳性率最高（7.5％）.结论 应用TALEN技术成功构建基因敲除大鼠,显微注射质粒浓度20 ng/μl时大鼠出生率不受影响且基因敲除阳性率最高.

TALENs:植物基因组定点剪辑的分子剪

随着高通量DNA测序技术的发展,获取生物全基因组序列已不再困难。结构基因组学和功能基因组学的巨大进展,使人类全面解码生物基因组的梦想正在逐步实现。接下来的问题是:如何按照人们的意愿对生物基因组进行定点改造?科学家早在1988年就开始探索植物基因组的定点改造技术,但进展十分缓慢。2009年,关于黄单胞菌效应子蛋白TAL effector与寄主靶基因DNA特异性识别分子密码的破解,使植物基因组定点改造呈现出新的曙光,目前已研发出可以对生物基因组进行定点剪辑的新技术——TALENs(TAL effector nucleases)。由于TAL effector识别DNA碱基的模式具有高度的专一性,而且可以简便地组装出特异性结合任意DNA序列的模块化蛋白,因此,TALENs成为目前最有发展前景的基因组修饰技术。本文综述了TALENs研发的背景、结构、工作原理和技术特点,重点介绍了利用TALENs定点改造植物基因组的一般策略和技术方案,最后对TALENs定点改造植物基因组的应用前景进行了讨论。

ZFN,TALEN和CRISPR/Cas9在小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的效率比较

哺乳动物黑色素的合成依赖于酪氨酸的氧化作用,而酪氨酸酶(Tyr)是催化酪氨酸氧化反应的关键酶,当外源Tyr基因整合进白毛色小鼠基因组中,会使它获得黑色素合成的能力,表现出与原来不同的毛色表型。为方便、快捷地获得Tyr基因整合的小鼠,构建了一个无启动子的pTyr-2A-DsRed同源重组质粒供体,选择Rosa26的第一个内含子作为外源基因整合的靶位点,设计了切割位点几乎一致的ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9系统。通过流式对比分析C 2C 12细胞中红色荧光蛋白DsRed的表达水平,比较了3种基因组编辑工具介导的外源基因定点整合效率,结果发现CRISPR/Cas9的效率最高,在此基础上,利用CRISPR/Cas9将供体整合到小鼠胚胎干细胞中,筛选单细胞克隆进行囊胚腔注射和胚胎移植,获得一只存活的嵌合体小鼠,表现出白毛中夹杂黑毛的表型,表明整合到小鼠Rosa26的Tyr基因可以正常表达。

利用TALENs技术制备瘦素基因敲除的大鼠

目的瘦素(leptin)是一种调节机体摄食和能量代谢的细胞因子,也参与神经细胞发育、免疫、糖脂代谢等,由于大鼠在代谢和神经研究等方面的优点,研制leptin基因敲除大鼠(leptin-/-),为这几方面的深入研究提供模型。方法利用类转录激活因子效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases,TALENs)技术,制备leptin-/-大鼠。利用称量方法测定不同时间点的体重变化,利用磁共振成像观测大鼠脂肪积累及分布,利用病理学方法观察胰腺的病理变化,并进行血生化、腹腔糖耐受实验及葡萄糖刺激下的血清胰岛素含量测定。结果获得一个在leptin基因编码区418～425位有8个碱基缺失的首建鼠,由于产生了TGA终止密码子,使该蛋白C末端缺失了28个氨基酸。Leptin-/-大鼠从5周龄开始出现显著的体重增加,到4月龄时体重比野生SD大鼠(leptin+/+)增加了52%。2月龄MRI结果显示leptin-/-大鼠与leptin+/+大鼠相比,在腹腔和皮下均有更多的脂肪积累,同时病理观察也发现leptin-/-大鼠胰腺中胰岛细胞显著增生。4月龄时,leptin-/-大鼠的血清中甘油三酯和胆固醇含量分别是leptin+/+大鼠的8.4倍和1.8倍,同时出现了明显的糖耐受受损和高胰岛素血症。结论利用TALENs技术成功建立了瘦素基因敲除大鼠,并表现出明显的肥胖、高胰岛素血、高脂血和糖代谢异常。结果表明:该敲除大鼠可作为代谢、神经、免疫等研究的潜在模型。

利用TALEN技术高效制备TXNIP基因敲除小鼠模型

目的利用显微注射技术注射敲除Txnip基因的TALEN mRNA获得TXNIP敲除小鼠。方法在线设计Txnip敲除位点,构建TALEN载体并在细胞水平验证剪切活性,体外转录TALENs成mRNA并通过显微注射技术注射到C57BL/6J小鼠受精卵,对F0代小鼠进行DNA水平鉴定获得TXNIP敲除小鼠。结果在Txnip第一外显子上设计了TALEN识别剪切位点,并在细胞水平验证具有剪切活性,注射mRNA到受精卵获得了4只敲除小鼠,其中2只Txnip发生移码突变,成功制备了TXNIP敲除小鼠。结论通过注射TALENs mRNA可以高效制备TXNIP敲除小鼠。

应用TALENs技术定向敲除烟草eIF4E-6基因

[目的]利用TALENs技术定向敲除烟草eIF4E-6基因,为提高优质烤烟品种K326的马铃薯Y病毒(PVY)抗性提供材料。[方法]构建特异靶向烟草eIF4E-基因的TALENs载体,并由农杆菌介导转化K326烟草,用PCR和克隆测序方法筛选目的基因被成功编辑的T_0代转基因烟株。[结果]构建了2个特异靶向eIF4E-6基因的TALENs载体T_3和T_4。2个载体各获得了约40和50株阳性转化的K326 T_0代烟株。T_3载体获得1株目的基因靶位点发生大片段碱基缺失的杂合突变型T_0代单株、3株靶位点发生碱基替换的杂合突变型T_0代单株。T_4载体获得5株靶位点发生碱基替换的杂合突变型T_0代单株。[结论]利用TALENs技术获得的eIF4E-6基因杂合突变型K326 T_0代单株为后续获得纯合基因敲除的K326烟草,并最终获得PVY病毒抗性改良的K326烟草材料奠定了基础。

基于比较转录组的水稻苗期耐冷相关基因BGIOSGA032296 TALEN基因组编辑技术构建

为了挖掘水稻苗期耐冷基因,基于比较转录组分析,参考公共数据库中的基因序列信息设计靶位点,对冷胁迫条件下东乡野生稻苗期下调表达耐冷相关基因BGIOSGA032296进行TALEN基因组编辑技术构建,克隆酶切鉴定和序列比对结果表明,BGIOSGA032296 TALEN敲除植物表达载体1301TALEN-032296构建成功,利用农杆菌介导法将TALEN敲除植物表达载体1301TALEN-032296转入水稻受体品种TP309,获得了17株转基因水稻植株,经潮霉素抗性标记基因和Fok I基因特异引物PCR检测,表明获得的转基因植株皆为携带1301TALEN-032296的阳性植株。该研究为水稻BGIOSGA032296基因后续耐冷表型鉴定奠定了前期基础。

TALEN表达载体构建技术研究进展

转录激活因子样效应蛋白核酸酶(TALEN)是最新出现的基因组定点修饰技术之一。该技术在应用过程中为保证靶点序列的特异性,编码转录激活因子样效应物(TALE)结构域的序列一般较长,这使得TALEN表达载体的构建成为该技术的一个关键步骤和应用中的主要瓶颈,为此发展了多种TALEN表达载体构建方法。本文主要对其中常见的Golden Gate法、REAL法、单元组装法、FLASH法、ICA法、LIC法等方法及其研究进展进行了总结。随着TALEN表达载体构建方法的进一步丰富和普及,该技术必将在生物基因功能研究、农作物和家畜性状改良、人类遗传疾病治疗方面展现出广阔的应用前景。

利用TALENs技术建立基因定点修饰的猪Oct-4-EGFP细胞系

本研究旨在建立一个用于干细胞示踪的报告体系,将EGFP cDNA及两侧带有LoxP位点的neo抗性基因插入五指山小型猪内源性Oct-4基因的终止密码子处,以Oct-4基因完整的5′调控区启动EGFP的表达,为猪干细胞研究提供有价值的工具。试验定制了针对猪Oct-4终止密码子的TALENs,与打靶载体共转染猪耳成纤维细胞,药物筛选得到抗性克隆点514个,经过PCR鉴定,共获得杂合阳性克隆点36个,打靶效率分别为5.6%和13.0%。本研究成功获得了Oct-4-EGFP转基因细胞系,并证明了TALENs技术可以明显提高同源重组效率。

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株

利用TALEN技术建立恒河猴TRIM5α基因突变细胞株,为进一步研究TRIM5α基因的功能奠定基础。构建针对TRIM5α打靶基因的TALEN,通过点突变的方法获得包含TRIM5α第7个外显子中打靶位点1 211-1 224的基因序列并构建点突变donor载体。将打靶TRIM5α基因的TALEN质粒和donor质粒电转入恒河猴肾细胞(LLC-MK2)中,无限稀释法获得单克隆细胞系,通过抽提基因组DNA,再利用PCR技术扩增目标序列并测序筛选出TRIM5α碱基缺失(1 215-1 216)和点突变(1 213-1 215,1 217)的细胞系。通过共转TALEN质粒和点突变的donor质粒筛选获得了TRIM5α基因敲除和TRIM5α基因点突变的LLC-MK2细胞系。

TALEN介导水稻OsTZF9基因定点突变研究

RR-TZF锌指基因在植物生长发育和胁迫反应中起着重要作用。利用TALEN基因组编辑技术定点突变水稻RR-TZF基因OsTZF9,结果表明:根据日本晴基因组中的OsTZF9基因序列,设计3对TALEN靶序列,并构建相应的3个TALEN植物敲除表达载体;通过农杆菌介导法分别将3个TALEN敲除载体导入水稻明恢86和秀水134的胚性愈伤组织中,获得了100个转化再生植株,PCR检测获得87个阳性植株;PCR扩增转基因植株靶突变区并测序列,发现所有转基因植株均未出现靶突变。

TALENs和CRISPR／Cas9诱导绵羊成纤维细胞基因组定点双链断裂提高Rad51基因表达量

为检测不同限制性人工核酸内切酶对绵羊成纤维细胞Rad51基因m RNA转录和蛋白表达的影响,本实验将有效切割MSTN(myostatin)基因位点的TALENs和CRISPR/Cas9人工核酸酶电转染到体外培养的绵羊成纤维细胞中诱导产生DNA双链定点断裂,与正常和电转染p Max绿色荧光蛋白报告基因质粒的绵羊成纤维细胞进行对照,采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法对不同处理的绵羊成纤维细胞Rad51基因m RNA转录和蛋白质的表达情况进行研究。结果表明:TALENs和CRISPA/Cas9人工核酸酶诱导产生的MSTN基因组DNA双链定点断裂能提高绵羊成纤维细胞Rad51基因表达量。

HEK293T细胞中验证靶向猪ApoE基因TALEN活性

为研究载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因功能以及构建转基因猪疾病模型,利用TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)在线设计工具及TALE质粒文库,组装特异性敲除猪ApoE基因的TALEN,并在HEK293T细胞中利用双荧光报告系统检测其活性。结果表明,共转染TALEN质粒及报告载体的试验组细胞检测到明显的绿色荧光信号,仅转染报告载体的对照组则没有信号。试验结果显示,TALEN可以在HEK293T细胞中工作,成功构建了靶向敲除猪ApoE基因的TALEN。

使用TALENs技术构建丁酰胆碱酯酶敲除小鼠模型研究

为了使用转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)技术构建丁酰胆碱酯酶(BChE)敲除小鼠模型,试验设计多对TALENs组合,合成相应的载体,并通过3T3细胞系对这些载体的活性进行检测,选择出活性最高的组合进行体外转录获得TALENs mRNA,并注射入小鼠受精卵中,对子代小鼠进行基因测序并筛选,最终获得BChE基因敲除小鼠。结果表明:针对4个基因位点设计并构建了30对TALENs组合,选择最优3L3-3R1组合进行体外转录并注射入小鼠受精卵,获得4只携带突变的F0代嵌合体小鼠;通过杂交及筛选,最终获得4只携带移码突变的F1代小鼠,可用于交配繁殖。说明通过TALENs技术可以稳定可靠地制备BChE基因敲除小鼠,并用于后续BChE功能的研究。

TALEN介导的CXCR4敲除肝癌细胞株的建立

通过TALEN打靶建立CXCR4的细胞株,旨在研究CXCR4对肝癌的影响。选用肝癌细胞株Hep G2,采用转录激活样效应物核酸酶(TALEN)干扰细胞中CXCR4的表达。构建的CXCR4 TALEN质粒转入Hep G2细胞,通过T7E1酶切确定打靶效率为40%,并通过测序筛选出了CXCR4敲除的单克隆细胞,免疫荧光和Western blot进一步证实CXCR4基因表达显著下调。