靶向抑制TANK结合激酶1表达对舌及下咽鳞癌细胞增殖及凋亡的影响

目的分析靶向抑制头颈部鳞癌细胞中TANK结合酶1(TANK binding,kinase 1,TBK1)表达后细胞增殖与凋亡水平改变。方法采用转染TBK1 siRNA靶向抑制人下咽鳞癌细胞FaDu、人舌鳞癌细胞Cal-27中TBK1的表达,用CCK-8、流式细胞术、Western Blot等方法检测FaDu及Cal-27中靶向抑制TBK1表达前后细胞的增殖及凋亡水平;克隆形成实验及细胞增殖实验(CCK-8法)检测梯度浓度氨来呫诺处理后FaDu及Cal-27细胞增殖改变。结果Western Blot结果显示,转染后FaDu及Cal-27细胞中TBK1蛋白表达显著抑制;细胞增殖实验结果显示,靶向抑制TBK1蛋白表达后,FaDu及Cal-27的增殖显著抑制;流式细胞术检测显示FaDu及Cal-27细胞凋亡显著增加;克隆形成及细胞增殖实验结果表明FaDu及Cal-27细胞的增殖随着氨来呫诺浓度增加呈现显著下降(P<0.05)。结论靶向抑制TBK1蛋白表达后,舌及下咽鳞癌细胞的增殖能力明显降低,细胞凋亡显著增加;TBK1抑制剂氨来呫诺对于高表达TBK1的舌及下咽鳞状细胞癌的增殖具有抑制作用。

人TANK结合激酶1的基因克隆、表达及生物活性鉴定

目的:克隆人TANK结合激酶1(TBK1)基因,构建其真核表达载体,检测该基因在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:应用RT-PCR方法,以HeLa细胞RNA为模板,扩增获得TBK1基因,定向克隆到pcDNA3-Flag载体中,以LipofectAMINE2000转染试剂转染pcDNA-Flag-TBK1至293细胞中进行瞬时表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,从人HeLa细胞总RNA中克隆到正确的TBK1基因全长编码序列,利用Western印迹检测其在293细胞中获得有效表达,利用萤光素酶报告基因实验检测TBK1可以诱导IFN-β转录激活。结论:真核表达的人TBK1具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。

IgA肾病患者TANK结合激酶1基因多态性与临床和病理表型的关系

目的探讨TANK结合激酶1(TBK1)基因多态性与IgA肾病患者临床和病理表型的关系。方法收集2010—2013年上海交通大学医学院附属新华医院肾脏科收治的经肾活组织病理学检查明确诊断为原发性IgA肾病的患者134例(IgA肾病组)和同期进行健康普查的健康志愿者140名(健康对照组)。应用聚合酶链反应产物直接测序法筛选TBK1基因21个外显子单核苷酸多态性(SNP)位点,对筛选到的SNP位点与IgA肾病患者的临床和病理表型进行相关性分析。结果 TBK1第8外显子c.1137T>A存在基因多态性,健康对照组TT、AT和AA基因型频率分别为40.7%、45.7%、13.6%,IgA肾病组分别为47.8%、42.5%、29.7%,两组间差异无统计学意义(χ=1.804,P=0.406);健康对照组等位基因T和A频率分别为63.6%、236.4%,IgA肾病组分别为69.0%、31.0%,两组间差异无统计学意义(χ=1.824,P=0.177)。IgA肾病组中,与AT基因型和TT基因型比较,AA基因型的收缩压(P=0.015)、24h尿蛋白定量(P=0.041)和血尿酸水平(P=0.006)均显著升高,IgA/C3比值(P=0.014)和Cockcorft-Gault方程计算的肾小球滤过率(P=0.048)显著降低。3种基因型间牛津病理分类系膜细胞增生积分的差异有统计学意义2(χ=6.336,P=0.042),其中AA基因型>50%肾小球出现系膜细胞增生的比例最高(M1为92.3%),AT基因型的比例最低(M1为54.5%)。结论 TBK1基因c.1137T>A与lgA肾病患者肾功能下降显著相关,提示TBK1在IgA肾病的发病和进展中可能起一定作用。

TBK1在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征

目的探讨TANK结合激酶1(TBK1)在高级别脑胶质瘤髓样细胞中的表达特征.方法选取2019年4月至2021年2月就诊于河北医科大学第二医院的27例WHO分级标准为高级别胶质瘤患者作为研究对象,采用磁珠分选的方法检测胶质瘤瘤旁和肿瘤组织中整合素αM(CD11b)阳性髓样细胞中TBK1的表达,免疫荧光染色观察肿瘤微环境巨噬细胞中磷酸化TBK1(p-TBK1)的表达,并通过流式细胞分析患者术前1 d、术后10~14 d外周血经典单核细胞中p-TBK1的表达变化.结果高级别胶质瘤肿瘤组织CD11b阳性细胞中TBK1总蛋白表达水平较瘤旁组织明显增多(P=0.006);高级别胶质瘤肿瘤组织中p-TBK1蛋白水平较瘤旁明显升高,且p-TBK1的表达与CD68阳性巨噬细胞有共定位;高级别胶质瘤患者术后外周血经典单核细胞中p-TBK1表达较术前明显降低(P=0.001).结论TBK1在高级别胶质瘤微环境髓样细胞中高表达,提示髓样细胞TBK1在胶质瘤的发展中可能起着关键调控作用.

PK-15细胞敲除TANK结合激酶1基因促进猪伪狂犬病病毒复制的研究

TANK结合激酶1(TBK1)是病毒感染时IRF3、IRF7磷酸化及Ⅰ型干扰素表达的关键酶,在抗病毒天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。为研究TBK1基因敲除对猪伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响,首先利用CRISPR/Cas9技术构建猪TBK1基因稳定敲除PK-15细胞系,并利用CCK-8检测敲除TBK1对PK-15细胞活力的影响。然后利用流式细胞术检测PRV-GFP荧光强度,用RT-qPCR检测PRV-gB、PRV-gE、PRV-TK、IL-1β、IFN-β和ISG15的转录水平,用Westernblot检测PRV-gB和PRV-gE蛋白表达水平,以及通过滴度测定检测子代病毒的感染力,综合评价TBK1基因稳定敲除PK-15细胞对PRV病毒复制的影响。结果显示:T7E1检测结果显示TBK1基因外显子2区的3个sgRNA靶位点均切出了目的条带,选取编辑效率最高的TBK1-sgRNA1细胞系进行单克隆化培养,获取6株稳定敲除TBK1基因的单克隆细胞,随机选取4号细胞株进行CCK-8检测,结果显示敲除TBK1对PK-15细胞活力无影响。流式检测结果显示PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15细胞的56.89%,PRV-GFP感染阳性细胞占总PK-15-TBK1-/-细胞的77.95%,表明PK-15-TBK1-/-细胞可以促进PRV-GFP复制。RT-qPCR及WB检测显示该细胞系可以促进PRVmRNA转录和蛋白表达。滴度测定结果显示,PRV-QXX在PK-15细胞复制后TCID50为10^6.8TCID50·0.1mL^-1,而在PK-15-TBK1-/-细胞中复制后TCID50为10^8.5TCID50·0.1mL^-1。另外,RT-qPCR结果显示该细胞系可以抑制PRV感染引起的IL-1β、IFN-β和ISG15转录上调。以上结果表明TBK1基因敲除PK-15细胞系促进PRV复制,可能与IL-1β、IFN-β和ISG15转录水平抑制有关。

TANK结合激酶1在抗病毒免疫应答中的作用研究进展

TANK结合激酶1（TBK1）是I型干扰素合成过程中最为关键的蛋白激酶，在抗病毒固有免疫应答中发挥重要的作用。TBK1可以被RIG—I—MAVS、cGAS．STING和TLR3／4-TRIF抗病毒信号通路所活化，作为重要的节点蛋白，其活化受到磷酸化、泛素化、SUMO化等一系列机制复杂而精密的调控。本文对TBK1在抗病毒免疫应答中的作用及其调控机制的研究进展进行综述。

日本鳗鲡TBK1基因的克隆与免疫功能分析

为了阐明鱼类TANK结合激酶1(TBK1)在免疫应答密切相关的NF-κB、I型IFN及MAPK信号通路中的调控作用,本实验通过cDNA末端快速扩增技术(SMART RACE)从日本鳗鲡中克隆了TBK1基因cDNA全长序列,命名为AjTBK1,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了在体和离体状态下不同病原体相关分子模式(PAMPs)及嗜水气单胞菌对日本鳗鲡AjTBK1基因表达水平变化的影响,通过构建绿色荧光蛋白pEGFP-TBK1和pCMV-TBK1真核表达质粒对AjTBK1亚细胞定位以及AjTBK1过表达对NF-κB、AP-1、IFN-β启动子荧光素酶活性的激活作用进行研究。蛋白质序列分析显示,日本鳗鲡AjTBK1编码731个氨基酸,其三维丝带空间结构与人类TBK1相似,具有保守的激酶结构域(KD)、泛素样结构域(ULD)、二聚化支架结构域(SDD)以及C端结构域(CTD),在系统发育树中与其他鱼类TBK1家族聚为一支。qRT-PCR检测发现AjTBK1在多种组织中广泛表达,且在肝脏和肠中高表达。经LPS、poly I:C、嗜水气单胞菌免疫注射后,AjTBK1基因表达水平在日本鳗鲡肝脏中显著提高,而肾脏中的表达量则在LPS和poly I:C刺激后显著降低。离体实验中,经LPS、poly I:C、PGN以及不同浓度嗜水气单胞菌刺激后的日本鳗鲡肝脏细胞AjTBK1基因表达水平均有显著升高。亚细胞定位结果显示,天然状态下的AjTBK1在HEK293细胞质中分布,经LPS和poly I:C刺激后呈聚集点状分布。此外,双荧光素酶活性检测发现过表达的AjTBK1可显著增强NF-κB、AP-1和IFN-β启动子荧光素酶活性。以上研究表明,AjTBK1可以通过激活NF-κB、AP-1和I型IFN信号通路,在机体抗细菌和抗病毒先天免疫应答中发挥重要的调控作用。

火炭母通过调控TLR4-TBK1信号通路改善鼠伤寒沙门菌感染小鼠空肠的炎症反应

为了探讨火炭母对鼠伤寒沙门菌感染小鼠空肠的免疫保护作用及其潜在机制。本试验将48只雌性BALB/c小鼠随机分为6个组:空白对照组、模型组、阳性药物组和火炭母高、中、低剂量组,每组8只。阳性药物组小鼠灌胃庆大霉素[20 mg/(kg·bw)],火炭母高、中、低剂量组小鼠分别按16、8和4 g/(kg·bw)剂量灌胃火炭母,空白对照组和模型组小鼠给予等体积的灭菌生理盐水,共连续给药8 d。预防性给药2 d后,每只小鼠(空白对照组除外)灌胃0.2 mL半数致死量(LD 50)鼠伤寒沙门菌(5×10^(4) CFU/mL)致病。给药结束后,处死小鼠取空肠用于组织病理学检查和Western blot。结果显示,鼠伤寒沙门菌感染后,小鼠空肠杯状细胞和肠腺红细胞增多、肠绒毛结构松散,火炭母各剂量组小鼠空肠杯状细胞和肠腺红细胞明显减少,火炭母减轻了小鼠空肠组织损伤。Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组小鼠空肠中免疫因子β干扰素(IFN-β)蛋白表达显著上升(P<0.05),γ干扰素(IFN-γ)蛋白表达显著下降(P<0.05),干扰素调节因子3(IRF3)、磷酸化TANK结合激酶1(p-TBK1)和Toll样受体4(TLR4)蛋白表达显著上调(P<0.05),炎性因子白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和核因子κB p65(NF-κB p65)蛋白表达显著上升(P<0.05);与模型组相比,不同剂量火炭母可以不同程度降低炎症因子IL-6(P<0.05或P>0.05)、IL-1β(P<0.05)和NF-κB p65(P<0.05)蛋白表达,显著提高TLR4、β干扰素TIR结构域衔接蛋白(TRIF)蛋白的表达和TANK结合激酶1(TBK1)蛋白表达及其磷酸化水平(P<0.05),提高下游信号IRF3蛋白的表达(P<0.05)及其磷酸化水平(P<0.05或P>0.05),进而提高空肠中IFN-β(P<0.05或P>0.05)和IFN-γ(P<0.05)蛋白的表达。结果表明,火炭母通过调控TLR4-TBK1信号通路改善鼠伤寒沙门菌感染小鼠空肠的炎症反应。

TBK1在胰腺癌中的表达及其与上皮间质转化的关系

目的研究TBK1(TANK binding kinase 1)在胰腺癌组织中的表达,并探讨其与胰腺癌恶性生物学行为及上皮间质转化(EMT)的关系。方法应用免疫组织化学技术SP法,检测50例胰腺癌组织中TBK1、间质源性标志物vimentin蛋白的表达,分析其与患者的临床病理资料的关系,以及二者的相关性。选择20例正常胰腺组织为对照组。结果在50例胰腺癌组织中TBK1染色阳性率为70%,与对照组(20%)比较差异有统计学意义(P<0.05)。TBK1的表达与与胰腺癌的分化程度、临床分期、淋巴结转移、远处转移存在相关性,差异具有统计学意义(P<0.05);vimentin表达阳性率为42%,对照组阳性率为0,两者间差异具有统计学意义(P<0.05);vimentin的阳性表达与胰腺癌组织的淋巴转移、远处转移明显相关(P<0.05);在胰腺癌组织中TBK1的表达与vimentin表达间具有正相关性(r=0.427,P<0.05)。结论 TBK1是反映胰腺癌恶性程度的肿瘤标记物,与胰腺癌侵袭、转移密切相关,可能源于TBK1参与了胰腺癌的EMT现象。

TANK结合激酶1在PINK1/Parkin依赖性和非依赖性线粒体自噬中的作用研究进展

线粒体自噬是一种清除受损或多余线粒体的过程,在调节细胞内线粒体质量和维持线粒体能量代谢等方面发挥重要作用。TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)是一种多功能的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,同时参与调控PTEN诱导假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin依赖性和非依赖性线粒体自噬过程。近期研究表明,TBK1可磷酸化视神经蛋白(optineurin,OPTN)、p62/sequestosome-1、Ras相关GTP结合蛋白7(Ras-related GTP binding protein 7,Rab7)等自噬相关蛋白,并介导核点蛋白52(nuclear dot protein 52,NDP52)与UNC-51样自噬激活激酶1(UNC-51 like autophagy activating kinase 1,ULK1)复合物相结合,以及TAX1结合蛋白1(TAX1-binding protein 1,TAX1BP1)与微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)相结合,从而增强PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬。TBK1亦可作为AMP活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)/ULK1自噬通路的作用底物而被激活,再通过磷酸化动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)、Rab7促进PINK1/Parkin非依赖性线粒体自噬。本文对TBK1在PINK1/Parkin依赖性和非依赖性线粒体自噬中的作用及机制进行了综述。

清热利湿活血方对HBV转基因小鼠的抗病毒作用及对TKB1-IRF3表达的影响

【目的】观察清热利湿活血方对乙型肝炎病毒(HBV)转基因小鼠的抗病毒作用及对肝组织TANK结合激酶1(TKB1)、干扰素调控因子3(IRF3)表达的影响,以阐明其作用机制。【方法】首先建立清热利湿活血方的HPLC指纹图谱。再将HBV转基因小鼠随机分为4组,即模型组,苦参素组,清热利湿活血方高、低剂量组,每组8只。苦参素组小鼠给予灌胃剂量为0.15 g·kg^(-1)·d^(-1)的苦参素混悬液,清热利湿活血方高、低剂量组小鼠分别给予灌胃剂量为7、2 g·kg^(-1)·d^(-1)的清热利湿活血方混悬液,给药共5周。治疗结束后,采用酶链免疫吸附法(ELISA)检测血清及肝组织乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg),采用常规苏木素—伊红(HE)染色观察肝组织病理变化,采用定量聚合酶链反应(qPCR)法检测血清中HBV DNA及肝组织中HBV DNA、TKB1 mRNA、IRF3 mRNA表达,采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测肝组织TKB1、IRF3的蛋白表达。【结果】标定14个特征峰构成清热利湿活血方的指纹图谱,其中1号峰为没食子酸,8号峰为柯里拉京,9号峰为虎杖苷,10号峰为鞣花酸,13号峰为甘草酸,14号峰为齐墩果酸。高剂量清热利湿活血方可减轻肝细胞轻度脂肪变性、肝细胞轻度水肿及Kuffer细胞增生等病理改变,显著降低HBV转基因小鼠肝脏和血清中的HBsAg、HBV DNA水平(P<0.05或P<0.01),显著增强小鼠TKB1、IRF3的mRNA及蛋白表达水平(P<0.05或P<0.01)。【结论】清热利湿活血方有抗HBV作用,其抗病毒机制可能与增强TKB1、IRF7 mRNA及蛋白表达,进而影响干扰素分泌有关。

干扰素调节因子3促结直肠癌细胞增殖与侵袭相关探索

目的·分析结直肠癌中干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)表达水平与临床病理特征及患者预后的关系,观察IRF3过表达对结直肠癌细胞增殖与侵袭能力的影响及其相关蛋白通路。方法·下载癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据,分析IRF3表达水平与恶性肿瘤患者(肾癌、结直肠癌、肝癌、前列腺癌)预后的关系。采用免疫组织化学法检测10例结直肠癌或肾癌患者的癌组织与癌旁正常组织切片中IRF3表达水平的差异。针对IRF3蛋白的C端残基位点进行改造,构建拟磷酸化IRF3-5D(396/398/402/404/405-D)高表达的HEK-293T细胞。分别在细胞培养12、24 h时,采用TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)抑制剂进行处理,并采用蛋白质印迹法检测细胞IRF3、p-IRF3(Ser386)蛋白表达水平。采用RNA测序技术探索IRF3-5D高表达与肿瘤相关蛋白表达水平的相关性。构建野生型IRF3(IRF3-WT)和IRF3-5D过表达的结直肠癌细胞CT26、COLON26,采用细胞计数法、细胞划痕试验和克隆形成试验检测细胞增殖及迁移能力。结果·TCGA数据分析提示癌组织中IRF3蛋白表达水平与患者的不良预后呈正相关。癌症患者病理组织免疫组织化学法显示,结直肠癌、肾癌组织中IRF3的表达水平显著上调,且蛋白表达集中于细胞核内。TBK1抑制剂分别在细胞培养12、24 h时间点作用后,HEK-293T细胞p-IRF3(Ser386)蛋白表达减弱。RNA测序和蛋白质印迹法结果显示,多个与癌症预后不良相关的蛋白[IRF9、细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1-ligand 1,PD-L1)等]表达水平在IRF3-5D高表达的条件下显著上调。结直肠癌细胞中过表达IRF3-5D,可导致癌细胞的增殖、迁移能力显著上调。结论·结直肠癌中IRF3表达水平与患者不良预后呈正相关。IRF3-5D蛋白在结直肠癌细胞内高表达后,促进癌细胞恶性生物学行为。此外,IRF3-5D依赖于TBK1介导的IRF3活化激活通路,并上调多个肿瘤相关蛋白的表达水平。

TBK1通过增强雌激素受体α的转录活性参与乳腺癌发生的分子机制

目的:研究乳腺癌细胞中TANK结合激酶1(TBK1)的功能及分子机制。方法:利用含有雌激素应答元件(ERE)的萤光素酶报告基因检测TBK1对雌激素受体α(ERα)转录活性的影响;将TBK1参与激活先天免疫途径的关键位点突变,使其丧失激活先天免疫的功能,再用同样方法检测TBK1突变体对ERα转录活性的影响;采用RT-PCR检测TBK1通过磷酸化修饰对ERα下游基因表达水平的影响。结果:TBK1增强ERα的转录活性,从而增强其下游基因的表达。结论:TBK1能以不依赖于其激活先天免疫途径功能的方式增强ERα的转录活性。

异钩藤碱对急性脑梗死大鼠认知障碍的影响及机制研究

目的探讨异钩藤碱对急性脑梗死大鼠认知障碍的影响及相应机制。方法将144只SD大鼠按照随机数字表法随机分为假手术组、急性脑梗死组、异钩藤碱低剂量组、异钩藤碱高剂量组、尼莫地平组、异钩藤碱高剂量+干扰素基因刺激蛋白(STING)激动剂(ADU-S100)组,每组24只。除假手术组外,其他各组大鼠均采用线栓闭塞大脑中动脉法构建急性脑梗死大鼠模型,假手术组仅游离右侧颈外动脉、颈总动脉和颈内动脉,不做插入线栓处理。建模成功后立即给药,异钩藤碱低剂量组和异钩藤碱高剂量组大鼠分别灌胃5 mg/kg、20 mg/kg异钩藤碱,且均需腹腔注射等量的等渗盐水;尼莫地平组大鼠需灌胃30 mg/kg尼莫地平,且还需腹腔注射等量的等渗盐水;异钩藤碱高剂量+ADU-S100组大鼠需灌胃20 mg/kg异钩藤碱且腹腔注射20 mg/kg ADU-S100;假手术组、急性脑梗死组大鼠均需灌胃10 ml/kg与腹腔注射10 ml/kg的等渗盐水。给药1次/d,持续2周。末次给药处理24 h后,采用Zela-Longa法对所有大鼠进行神经功能评分,并进行Morris水迷宫实验,记录大鼠的逃避潜伏期及原平台象限停留次数。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测大鼠血清中白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平;检测各组大鼠脑组织含水量;采用2,3,5-三苯基四唑氯化物(TTC)染色测定各组大鼠脑梗死体积;采用伊文思蓝检测各组大鼠血-脑屏障通透性;采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测大鼠脑组织中闭锁小带蛋白1(ZO-1)、闭合蛋白(occludin)信使核糖核酸(mRNA)表达;采用免疫印迹检测大鼠脑组织中STING、磷酸化TANK结合激酶1(p-TBK1)、磷酸化干扰素调节因子3(p-IRF3)蛋白表达,并进行组间比较。结果(1)与假手术组相比,急性脑梗死组末次给药处理24 h后神经功能评分[(2.96±0.32)分比0分]、脑组织含水量[(86.9±3.2)%比(71.8±3.1)%]、血清TNF-α[(86.7±3.5)ng/L比(35.6±1.7)ng/L]、IL-6[(167.8±6.1)ng/L比(50.2±2.2)ng/L]、脑梗死体积[(28.6±1.3)mm 3比0 mm 3]、脑组织中伊文思蓝含量[(1.57±0.13)g/L比(0.96±0.08)g/L]及STING[(1.83±0.16)比(0.86±0.08)]、p-TBK1[(0.89±0.07)比(0.41±0.03)]、p-IRF3[(0.67±0.05)比(0.13±0.01)]蛋白表达均升高,脑组织中ZO-1 mRNA[(0.45±0.04)比(1.00±0.00)]、occludin mRNA[(0.23±0.02)比(1.00±0.00)]表达均降低,逃避潜伏期延长[(33.6±1.6)s比(12.3±0.5)s],原平台象限停留次数减少[(5.9±0.2)次比(15.7±0.4)次],组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。(2)与急性脑梗死组比较,异钩藤碱低剂量组、异钩藤碱高剂量组、尼莫地平组大鼠末次给药处理24 h后神经功能评分[(2.37±0.21)、(1.14±0.17)、(1.18±0.13)分比(2.96±0.32)分]、脑组织含水量[(81.8±3.0)%、(74.9±3.0)%、(74.3±2.9)%比(86.9±3.2)%]、血清TNF-α[(71.1±1.4)、(43.4±2.0)、(41.5±1.9)ng/L比(86.7±3.5)ng/L]、IL-6[(129.8±5.4)、(81.2±3.8)、(80.0±3.6)ng/L比(167.8±6.1)ng/L]、脑梗死体积[(21.7±1.0)、(10.5±0.5)、(10.7±0.5)mm 3比(28.6±1.3)mm 3]、脑组织中伊文思蓝含量[(1.39±0.12)、(1.16±0.10)、(1.18±0.19)g/L比(1.57±0.13)g/L]及STING[(1.50±0.14)、(1.02±0.11)、(1.01±0.09)比(1.83±0.16)]、p-TBK1[(0.75±0.05)、(0.54±0.04)、(0.52±0.05)比(0.89±0.07)]、p-IRF3[(0.51±0.05)、(0.25±0.02)、(0.27±0.02)比(0.67±0.05)]蛋白表达均降低,脑组织中ZO-1 mRNA[(0.58±0.05)、(0.87±0.07)、(0.89±0.09)比(0.45±0.04)]、occludin mRNA[(0.36±0.03)、(0.71±0.06)、(0.69±0.05)比(0.23±0.02)]表达均升高,逃避潜伏期缩短[(28.6±1.0)、(16.5±0.7)、(16.4±0.7)s比(33.6±1.6)s],原平台象限停留次数增加[(8.2±0.3)、(12.8±0.5)、(12.9±0.5)次比(5.9±0.2)次],组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。(3)与异钩藤碱高剂量组比较,异钩藤碱高剂量+ADU-S100组末次给药处理24 h后神经功能评分[(2.12±0.14)分比(1.14±0.17)分]、脑组织含水量[(78.7±3.2)%比(74.9±3.0)%]、血清TNF-α[(59.7±2.1)ng/L比(43.4±2.0)ng/L]、IL-6[(118.9±4.6)ng/L比(81.2±3.8)ng/L]、脑梗死体积[(16.6±0.4)mm 3比(10.5±0.5)mm 3]、脑组织中伊文思蓝含量[(1.36±0.10)g/L比(1.16±0.10)g/L]及STING[(1.37±0.12)比(1.02±0.11)]、p-TBK1[(0.67±0.05)比(0.54±0.04)]、p-IRF3[(0.39±0.03)比(0.25±0.02)]蛋白表达均升高,脑组织中ZO-1 mRNA[(0.63±0.05)比(0.87±0.07)]、occludin mRNA[(0.46±0.05)比(0.71±0.06)]表达均降低,逃避潜伏期延长[(23.4±1.0)s比(16.5±0.7)s],原平台象限停留次数减少[(9.6±0.3)次比(12.8±0.5)次],组间差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论异钩藤碱可抑制急性脑梗死大鼠炎症、减少血-脑屏障损伤、降低脑水肿程度,改善认知障碍,其机制可能与抑制STING/TBK1/IRF3通路有关。

TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的构建、表达及生物活性鉴定

目的:构建TANK结合激酶1(TBK1)相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,检测该基因相关突变体在293细胞中的表达,并利用萤光素酶报告基因实验检测其生物活性。方法:根据文献报道的突变序列及QuickChange Site-Directed Mutagenesis实验设计手册,设计合成2条针对TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体的引物,以实验室之前构建的TBK1野生型真核表达载体为模板,构建TBK1激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体真核表达载体,分别命名为pcDNA3-Flag-TBK1(KD)、pcDNA3-Flag-TBK1(ΔULD)。以LipofactAMINE2000转染试剂转染至293细胞中进行瞬时表达,利用萤光素酶实验检测2种TBK1突变体诱导β干扰素(IFN-β)转录的情况。结果:测序结果表明,TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体真核表达载体构建成功,Western印迹检测表明其在293细胞中获得有效表达;用萤光素酶报告基因实验检测,与野生型TBK1相比,其相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域缺失突变体诱导IFN-β转录激活的作用明显降低。结论:真核表达的TBK1相关激酶活性缺失突变体和泛素样结构域突变体具有相应的生物学活性,为研究其功能奠定了基础。

人TBK1小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰TBK1细胞株的筛选

目的:构建人TANK结合激酶1(TBK1)的小干扰RNA真核表达质粒,并筛选出稳定干扰TBK1的细胞株。方法:根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对TBK1的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后得到质粒psiTBK1。用脂质体转染质粒psiTBK1到MCF-7细胞中,经G418加压筛选稳定表达TBK1小干扰RNA的细胞株,用免疫印迹检测细胞中TBK1的表达情况,将干扰效果好的细胞株命名为MCF-7/siTBK1,再用萤光素酶试验检测MCF-7/siTBK1细胞对外源TBK1诱导干扰素-β(IFN-β)转录的情况。结果:免疫印迹结果证实建立的稳定细胞株MCF-7/siTBK1能够有效干扰TBK1的表达,并在外源TBK1存在的情况下抑制IFN-β的转录活性。结论:构建了表达TBK1小干扰RNA的质粒psiTBK1,筛选出稳定干扰TBK1表达的细胞株MCF-7/siTBK1,为深入研究TBK1在先天免疫中的作用提供了平台。

IKKε及TBK1在肥胖、糖尿病及NAFLD中的作用机制研究进展

核因子κB激酶抑制剂ε(IKKε)及TANK结合激酶1(TBK1)是IKK家族中的新成员,是核因子κB(NF-κB)信号转导通路中的重要调节因子,在代谢性疾病中具有重要作用,不仅可降低肥胖小鼠脂肪细胞中的β肾上腺素受体对儿茶酚胺的敏感性及细胞内第二信使cAMP的水平,而且可调节胰腺β细胞的再生。阻断IKKε及TBK1信号通路可促进脂肪组织的能量消耗,减少脂肪细胞中慢性炎性因子的表达,增强胰岛素敏感性,减少胰岛素抵抗,减轻体重,防止高脂饮食引起的肥胖。该文综述了IKKε及TBK1的结构和功能,以及IKKε和TBK1在肥胖、2型糖尿病(T2DM)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中调节代谢的分子机制,并讨论了氨来占诺作为TBK1及IKKε抑制剂治疗代谢性疾病的潜力。

TBK1的O-GlcNAc修饰促进LPS诱导的BV-2小胶质细胞炎性介质的释放

目的:研究TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)O-连接的N乙酰葡萄糖胺(O-Glc NAc)修饰对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小胶质细胞炎性介质释放的影响。方法:选取小鼠小胶质细胞株BV-2,利用免疫沉淀方法检测TBK1的O-Glc NAc修饰状况;构建野生型TBK1和丝氨酸266号糖基化位点突变的TBK1即S266A质粒。用酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测BV-2细胞中炎症因子的分泌。结果:LPS诱导BV-2中TBK1的蛋白表达。TBK1存在O-Glc NAc修饰。过表达野生型TBK1能增加LPS诱导的小胶质细胞中炎性介质肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和干扰素γ(interferonγ,IFN-γ)的释放;N-乙酰氨基葡萄糖苷酶抑制剂PUGNAc能增强TBK1的该效应。而过表达S266A能抑制LPS诱导的小胶质细胞炎性介质的释放。结论:TBK1通过丝氨酸266号位的O-Glc NAc修饰增强LPS诱导的小胶质细胞炎性介质的释放。

过表达TBK1通过调控RIPK1信号通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞凋亡的抑制作用

目的探讨TANK结合激酶1(TBK1)对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞(RGC)凋亡的作用机制。方法按60 mg·kg^(-1)腹腔一次性注射链脲佐菌素制备糖尿病模型。模型制备完成后,随机分成三组糖尿病(DM)组、TBK1过表达(TBK1-OE)组(大鼠玻璃体内单次注射TBK1过表达慢病毒载体5μL,病毒滴度为1.0×10^(9)IU·mL^(-1))、TBK1空载体(TBK1-NC)组(玻璃体内注射等剂量病毒包装的阴性对照液),另取正常大鼠作为对照(CON)组,每组15只。12周后,免疫荧光染色检测大鼠视网膜TBK1蛋白表达定位,Hoechst 33342染色检测大鼠视网膜RGC凋亡,ELISA检测大鼠视网膜肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)含量,Western blot检测大鼠视网膜TBK1、受体相互作用蛋白激酶1(RIPK1)、Caspase-3蛋白相对表达量。结果TBK1在大鼠RGC中特异表达。与CON组相比,DM组、TBK1-NC组大鼠RGC凋亡率,TNF-α、IL-6、IL-1β含量,RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量均明显增加,TBK1蛋白相对表达量均明显降低(均为P<0.01);TBK1-OE组各指标均增加(均为P<0.01);而与DM组相比,TBK1-OE组大鼠RGC凋亡率,TNF-α、IL-6、IL-1β含量,RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量均明显降低,TBK1蛋白相对表达量明显增加(均为P<0.01)。而DM组与TBK1-NC组大鼠之间RGC凋亡率,TNF-α、IL-6、IL-1β含量,TBK1、RIPK1、Caspase-3蛋白相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论过表达TBK1对糖尿病大鼠RGC凋亡具有抑制作用,其机制与阻断RIPK1信号通路激活有关。

TANK结合激酶1在乙型肝炎病毒诱导抗病毒反应中的表达及作用

目的探讨TANK结合激酶1（TBK1）在慢性HBV感染后诱导的IFN抗病毒免疫反应中的表达及作用。方法选取HBeAg阳性的慢性乙型肝炎（CHB）患者28例，健康对照者27例，经免疫磁珠细胞分选（MACS）法获得纯化的CD14＋单核细胞，用人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）、hIL-4诱导单核细胞成为未成熟的髓样树突状细胞（mDC），加入Poly I：C25mg／L刺激后，获得成熟mDC。在Poly I：C刺激后分别于0、12、24、48h收集培养上清液及细胞，用实时PCR法检测TBK1、干扰素调节因子3（IRF3）和IFN—β mRNA的表达，ELISA法检测mDC细胞上清液中IFN-β的变化。数据行单因素方差分析。结果CHB组与健康对照组mDC上TBK1 mRNA 0h的表达差异无统计学意义（P〉0．05）。健康对照组mDC经Poly I：C刺激后12h TBK1 mRNA的表达水平明显升高（P〈0．05），24h、48h逐渐下降。而患者组mDC刺激后12、24、48h TBK1 mRNA的表达上升不明显（P〉0．05）。与TBK1 mRNA的表达一致，健康对照组mDC 12h IRF3 mRNA的表达水平显著升高（P〈0．05），患者组mDC中IRF3 mRNA的表达未随时间变化。同样两组mDC上0h IFN-β mRNA的表达水平及细胞上清液中IFN-β的浓度差异无统计学意义（P〉0．05）。健康对照组mDC在12h IFN-β mRNA的表达水平及IFN-β的浓度与0h相比显著升高（P〈0．05），较患者组0、12、24、48h IFN-β的表达显著升高（P〈0．05）。而患者组mDC刺激后12、24和48h IFN-β mRNA及IFN-β表达水平与0h相比无显著变化。结论mDC表面的受体与配体结合后，宿主抗病毒信号通路转导可能存在障碍。HBV慢性感染患者在感染病毒后不能分泌足够的IFN-β，可能是HBV慢性持续感染的原因之一。