Tat-p53融合蛋白的表达、纯化及其转导活性

目的:原核表达野生型p53与TatPTD(proteintransductiondomain)的融合蛋白,检测TatPTD介导p53进入肝细胞的效率。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因分别克隆入pTAT-HA和pET-32a原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。以纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。将Tat-p53融合蛋白加入HepG2细胞培养上清,利用间接免疫荧光法检测Tat-p53融合蛋白导入HepG2细胞的效率。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白及p53蛋白,制备p53特异的抗血清,证实Tat-p53可以高效的转入HepG2细胞内。结论:Tat-p53融合蛋白的表达纯化及活性分析,为应用Tat-p53融合蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了基础。

Tat-p53融合蛋白在乳腺癌细胞的表达、纯化及其转导活性

目的:研究Tat-p53融合蛋白在乳腺癌细胞的表达、纯化及其转导活性,探讨蛋白转导方法在乳腺癌治疗中应用的可能性。方法:利用RT-PCR方法从A549细胞系中分离野生型p53基因,将该基因克隆入pTAT-HA原核表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行纯化。将Tat-p53融合蛋白加入MCF-7人乳腺癌细胞培养上清,检测Tat-p53融合蛋白导入MCF-7人乳腺癌细胞的情况。结果:成功地构建了含有野生型p53基因的原核表达载体,表达纯化了Tat-p53融合蛋白,证实Tat-p53可以高效转入MCF-7人乳腺癌细胞内。结论:TatPTD可以发挥高效的蛋白转导特性将p53导入人乳腺癌细胞,p53在细胞核内可以发挥生物学活性,抑制肿瘤细胞生长并诱导其发生凋亡。

融合蛋白TAT-p53-MTS的促细胞凋亡作用

本研究首先构建了融合蛋白TAT-p53-MTS的原核表达质粒pET-22b(+)-TATp53-MTS,将表达纯化的融合蛋白与p53缺陷型人肺癌细胞NCI-H1299孵育,通过Western blot和免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,co-IP)检测融合蛋白的细胞穿膜以及与Bcl-2蛋白的相互作用,并通过流式细胞术检测融合蛋白对NCI-H1299细胞的促凋亡作用.结果显示,融合TAT和MTS的p53重组蛋白具有更强的细胞穿膜及线粒体定位能力;并且,融合蛋白能够通过与Bcl-2蛋白的结合显著诱导NCI-H1299细胞的凋亡.

促黄体激素释放激素-TAT-p53融合蛋白制备及其对肿瘤细胞增殖作用的影响

目的制备促黄体激素释放激素(luteinizing hormone releasing hormone,LHRH)-TAT-p53融合蛋白,探讨其抗肿瘤作用。方法以重组质粒pET28a-p53为模板,经PCR扩增目的基因,双酶切,克隆至原核表达载体p ET20b中,构建重组表达质粒p ET20b-LHRH-TAT-p53,并在E. coli中IPTG诱导表达,经金属螯合层析、DEAE弱阴离子交换层析纯化目的蛋白。取对数生长期的HeLa、BGC及MDCK细胞进行细胞活性试验,检测pET28a-p53蛋白活性。结果经双酶切及测序鉴定,重组质粒pET20b-LHRH-TAT-p53构建正确;融合蛋白相对分子质量约54 000,主要以包涵体形式存在,表达量约占菌体总蛋白55%;HeLa及BGC细胞加入纯化复性的重组蛋白后,细胞变圆、色暗、折光性变差,甚至裂解死亡,细胞死亡数增加,而MDCK细胞无变化;一定浓度范围内(25~120μg/m L)蛋白对HeLa及BGC细胞有明显的抑制作用。结论成功制备了LHRH-TAT-p53融合蛋白,该蛋白具有生物活性,对肿瘤细胞有杀伤作用。本研究为下一步制备靶向LHRH的肿瘤治疗药物提供了参考。

p53-TAT融合蛋白的克隆表达及其对HepG 2细胞的促凋亡作用

目的研究连接TAT蛋白转导域的p53融合蛋白对人肝癌细胞株HepG 2的促凋亡作用。方法用反转录法从人正常肝细胞株L-02中获得野生型p53基因cDNA,构建原核表达质粒pET-27b/p53及pET-27b/p53-TAT。IPTG诱导表达重组蛋白,重组蛋白经N-i NTA柱纯化后,加入HepG 2细胞培养液上清,采用四唑氮盐比色法(MTT法)和单细胞凝胶电泳法检测p53及p53-TAT融合蛋白对HepG 2细胞生长的影响。结果成功构建质粒pET-27b/p53及pET-27b/p53-TAT,表达纯化了p53蛋白及p53-TAT蛋白。MTT法和单细胞凝胶电泳法结果表明,与p53蛋白相比,p53-TAT融合蛋白能更有效地抑制HepG 2细胞生长、促进凋亡。结论 p53-TAT融合蛋白能够有效促进HepG 2细胞凋亡。

TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫

目的:探讨TAT-p53融合蛋白转导进入红内期恶性疟原虫的特性.方法:将纯化的TAT-p53融合蛋白和p53蛋白分别与培养疟原虫共孵育30min后,制备血涂片,利用间接免疫荧光方法检测融合蛋白的转导.同时计算融合蛋白与疟原虫共孵育12h前后的感染率变化,观察蛋白转导对疟原虫生长的影响.结果:TAT-p53融合蛋白可以突破红内期疟原虫各层细胞膜,进入虫体细胞内,并可根据荧光观察到融合蛋白主要分布在疟原虫滋养体和晚期裂殖体,而p53蛋白不能进入疟原虫内.融合蛋白与疟原虫共孵育12h后其感染率与对照组之间无显著差异(P>0.05),说明蛋白转导对疟原虫的生长没有影响.结论:TAT融合蛋白可以转导进入疟原虫内,这将为疟原虫相关基因功能的研究提供一种新方法.

介导p73去阻抑肽表达的重组腺伴病毒的构建和鉴定

目的构建编码融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT的重组腺伴病毒表达载体,为恶性肿瘤基因治疗的实验研究奠定基础。方法采用互补引物二次PCR法以及T载体克隆法获得p53(N37)基因克隆,酶切后将其连同穿膜肽HA2-TAT片段一起连入pUC19/NT4质粒,再将融合基因NT4-p53(N37)-HA2-TAT亚克隆至腺伴病毒的穿梭质粒pSSHG-CMV中,构建重组质粒pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并进行酶切鉴定;应用磷酸钙沉淀法,pSSHG-CMV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT、辅助质粒pAAV-Ad,腺病毒全基因组质粒pFG140三种质粒共转染HEK293细胞,包装出重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT并用斑点杂交法测定重组病毒的滴度;MTT比色法、流式细胞仪观察重组腺伴病毒rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT对HepG2细胞的抑制作用。结果克隆出p53(N37)基因,经酶切及测序证实结果正确;得到高滴度的(2×1013pfu/L)重组腺伴病毒表达载体并对HepG2细胞有明显的抑制作用,且这一作用是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的。结论通过分子克隆体外重组技术成功制备了rAAV/NT4-p53(N37)-HA2-TAT复制缺陷型重组腺伴病毒,为下一步开展在p53突变或缺失肿瘤中针对p73的靶向性肿瘤基因治疗研究奠定了基础。

体内蛋白传导及其在生物学上的应用前景

蛋白传导域 PTDs是在蛋白传导过程中能高效穿过生物膜的结构域。其可以使所有细胞作为传导对象 ,而且具有相当高的传导效率 ,但其传导的机制尚不明了。目前所发现的高效的 PTDs有 Tat,VP2 2 ,ANTP。当它们形成嵌合蛋白 ,或与蛋白质、多肽、DNA等分子化学相连 ,用于化合物的体内传导时 ,无论对于生物学上的理论问题还是基因治疗中的实际应用都有重大的意义。