结核分枝杆菌蛋白TB9.7间接ELISA方法的建立

为获得新的鉴别诊断结核杆菌感染的候选抗原,根据Gene Bank中登录的结核杆菌H37Rv的TB 9.7基因序列设计1对引物,以结核杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR扩增得到TB 9.7基因DNA片段。将该扩增片段克隆于PMD18-T载体中,得到载体PMD18-T-TB9.7。分别将pET32a质粒和PMD18-T-TB 9.7质粒用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,并将纯化的TB 9.7基因亚克隆至pET32a中,获得重组表达质粒pET32a-TB 9.7。将其转化E.coli BL21 IPTG诱导后,经SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,可见约30ku的外源蛋白带。表明TB9.7基因在大肠杆菌中得到了表达。用Ni-NTA Agarose试剂盒进行蛋白纯化,获得纯化的TB9.7融合蛋白,建立间接ELISA诊断方法,检测了30份结核病人的痰检阳性血清,120份健康人的血清,敏感性为56.6%,特异性为97%,与痰检结果的符合率为84%。